Правда 8D: Документальное доказательство: Университет Северной Каролины сгенерировал COVID-19

суббота, 15 июля 2023 г.

Документальное доказательство: Университет Северной Каролины сгенерировал COVID-19

Исследования по созданию COVID-19 начались в Соединенных Штатах в 2006 году и завершились успешным созданием биологического оружия в 2015 году, когда работа была проведена в Университете Северной Каролины и Гарварде, а также в лаборатории Управления по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов в Арканзасе. Доказательство предоставлено

Гордон Дафф

Эта статья содержит неопровержимые доказательства, которые нельзя подвергнуть сомнению или опровергнуть, и которые вы можете представить любому государственному учреждению или медицинскому работнику.

Что еще не доказано, но становится все более очевидным, так это то, что программа США по биологическому оружию в Форт-Детрик, штат Мэриленд, оборудование и, безусловно, ключевой персонал, безусловно, мигрировали в секретные лаборатории в крупных государственных университетах, чтобы «спрятаться на виду».

Следите за карьерой (все ссылки включены) тех, кто работал над проектом Wuhan-COVID в 2017 году.

Также обратите внимание, что для фальшивых исследований и испытаний «предотвращения» используется тот же самый персонал и оборудование, что и для создания оружия и реального производства.

С тех пор, как была написана эта статья, мы начали изучать мировые операции американского ядерного/био/химического подрядчика, фаворита Кушнера-Трампа, Battelle, и их секретных лабораторий по всему миру.

Когда мы начали, нашим людям начали угрожать. Это была серьезная ошибка.

Отправьте эту статью любому врачу или другому квалифицированному специалисту в области биологических наук. Посмотрите, что они говорят.

Введение

Приведенные ниже документы покажут, что исследования по созданию COVID-19 начались в Соединенных Штатах в 2006 году и завершились успешным созданием биологического оружия в 2015 году, работа проводилась в Университете Северной Каролины и Гарварде, а также в лаборатории Управления по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов в Арканзасе. .

Их работа называлась:

Подобный SARS кластер циркулирующих коронавирусов летучих мышей показывает потенциал для появления человека

Они сделали это и многое другое, о чем вы прочтете ниже.

Как неоднократно заявлял Трамп, в этом замешаны китайцы.

Ключевая лаборатория особых патогенов и биобезопасности Уханьского института вирусологии Китайской академии наук, Ухань, Китай предоставил вирус уханьской летучей мыши, который использовался в американском исследовании. Их имя было включено только по этой причине.

COVID 19 был проектом армии США по созданию биологического оружия для производства вызывающего пневмонию заболевания, которое было бы практически невозможно вакцинировать для стационарных пациентов старше 40 лет.

Для доказательства нажмите здесь

История изменений

20 ноября 2015 г.

В версии этой статьи, первоначально опубликованной в Интернете, авторы не упомянули Z.-LS источник финансирования, финансирование USAID-EPT-PREDICT от EcoHealth Alliance. Ошибка была исправлена для печатной версии, версии PDF и HTML версии этой статьи. .

[Примечание редактора: теперь мы представим предвзятую статью «Правды», а ниже — фактическое исследование, доказывающее способность производить COVID-19, раз и навсегда доказывающее, что это не естественный вирус.

Что касается того, кто что сделал, это не наша работа, но мы категорически доказываем, что когда упоминается китайская лаборатория, она является второстепенным игроком в усилиях Америки, как подробно изложено ниже.

Это делает обсуждение уханьской лаборатории возможной причастностью к биологической войне.

Точно так же, когда журнал Forbes и другие заявили, что могут доказать, что COVID 19 был создан естественным путем, и, конечно же, у них был такой же доступ, как и у нас, мы подозреваем, что они являются частью усилий по дезинформации, связанных с USAID и биологической войной.

Подозрение не является доказательством. Доказательство есть доказательство, и доказательств достаточно, чтобы в них можно было утонуть. Мы благодарим американских медицинских работников, которые продали себя армии США и ЦРУ и помогли привести нас к тому, что мы имеем сейчас, нации, разбитой на части… VeteransToday ]

Правда.Ру: Такой материал появился в 2015 году на сайте научного журнала Natura 2015. Тогда авторы утверждали, что после появления вируса атипичной пневмонии (2002-2003 гг.) и ближневосточного респираторного синдрома (БВРС) ученым стало известно о риск межвидовой передачи, что приведет к эпидемии среди людей.

Успешный лабораторный эксперимент

Среди прочего исследовательская группа изучала летучих мышей, которые являются крупнейшими инкубаторами коронавирусов. Тем не менее, летучие мыши не могли передать коронавирус человеку, поскольку не могли взаимодействовать с клетками человека с рецепторами ACE2.

В материале также указано, что подковоносы являются переносчиками штамма коронавируса SARS, который может передаваться человеку. Он был назван вирусом SHC014-CoV.

Чтобы лучше изучить этот вирус, ученые скопировали коронавирус и заразили им лабораторных мышей. Результаты показали, что вирус действительно способен связываться с клетками человека с рецепторами ACE2 и размножаться в клетках дыхательной системы.

В исследовательской работе отмечается, что лабораторные материалы, образцы и оборудование, которые использовались в исследованиях, были получены из Военно-медицинского научно-исследовательского института инфекционных болезней. Хотя пока нельзя точно сказать, что вирус, который тестировали на лабораторных мышах, и есть коронавирус SARS-Cove-2.

политика НАТО

Однако интересные вещи можно найти и в более ранних документах.

Например:

В отчете о деятельности Альянса за 2019 г. говорится, что в 2019 г. первое место в исследованиях и разработках Альянса занимала тема радиохимической и биологической защиты (29%), смещая, казалось бы, самую острую проблему Европы – борьбу с терроризмом (она оказалась на 4 - м приоритет).
Годом ранее, в 2018-м, ситуация была прямо противоположной: терроризм, как и положено, был на первом месте (28%), а радиохимическая и биологическая защита — на четвертом (13%).

Как пишет брюссельский стукач в телеграм-канале, «учитывая отсутствие видимых причин столь резкой смены научных интересов, есть два варианта и оба неприятные:

или НАТО сейчас виляет пятой точкой, фальсифицируя данные, чтобы показать "а мы всегда были готовы к вирусам, мы современные",
или даже в 2019 году в альянсе, прости господи, знали откуда беда.

Да, первый вариант куда более реален, но, согласитесь, факты удивляют.

Источник: Правда

Оригинальное исследование 2015 г., неотредактированное и полное

Опубликовано: 09 ноября 2015 г. Кластер циркулирующих коронавирусов летучих мышей, похожий на атипичную пневмонию, показывает потенциал для появления человека Винит Д. Менахери, Бойд Л. Юнт-младший, Кари Деббинк, Судхакар Агнихотрам, Лиза Э. Гралински, Джессика А. Планте, Рэйчел Л. Грэм, Тревор Скоби, Син -Йи Гэ, Эрик Ф. Дональдсон, Скотт Х. Рэнделл, Антонио Ланзавеккья, Уэйн А. Мараско, Чжэнли-Ли Ши, Ральф С. Барик

Nature Medicine том 21, страницы 1508–1513 (2015)

Исправление к этой статье было опубликовано 06 апреля 2016 г.

Эта статья была обновлена

Абстрактный

Появление коронавируса тяжелого острого респираторного синдрома (SARS-CoV) и ближневосточного респираторного синдрома (MERS)-CoV подчеркивает угрозу межвидовой передачи, приводящей к вспышкам среди людей. Здесь мы исследуем болезнетворный потенциал SARS-подобного вируса, SHC014-CoV, который в настоящее время циркулирует в популяциях китайских подковоносых летучих мышей ¹ . Используя систему обратной генетики SARS-CoV ² , мы создали и охарактеризовали химерный вирус, экспрессирующий шип коронавируса летучих мышей SHC014 в адаптированном для мышей позвоночнике SARS-CoV.

Результаты показывают, что вирусы группы 2b, кодирующие шип SHC014 в остове дикого типа, могут эффективно использовать несколько ортологов человеческого ангиотензинпревращающего фермента II (ACE2) рецептора SARS, эффективно реплицироваться в первичных клетках дыхательных путей человека и достигать титров in vitro , эквивалентных эпидемические штаммы SARS-CoV. Кроме того, эксперименты in vivo демонстрируют репликацию химерного вируса в легком мыши с заметным патогенезом.

Оценка доступных иммунотерапевтических и профилактических средств на основе SARS выявила низкую эффективность; как моноклональное антитело, так и вакцинный подход не смогли нейтрализовать и защитить от инфекции CoV с использованием нового шиповидного белка.

На основании этих результатов мы синтетически повторно получили инфекционный полноразмерный рекомбинантный вирус SHC014 и продемонстрировали надежную репликацию вируса как in vitro, так и in vivo . Наша работа предполагает потенциальный риск повторного появления SARS-CoV из-за вирусов, циркулирующих в настоящее время в популяциях летучих мышей.

Основной

Появление SARS-CoV ознаменовало новую эру межвидовой передачи тяжелых респираторных заболеваний с глобализацией, ведущей к быстрому распространению по всему миру и огромному экономическому воздействию ^3,4 . С тех пор несколько штаммов, в том числе штаммы гриппа А H5N1, H1N1 и H7N9, а также MERS-CoV, появились в популяциях животных, вызывая серьезные заболевания, смертность и экономические трудности в пострадавших регионах ⁵ . Хотя меры общественного здравоохранения смогли остановить вспышку SARS-CoV ⁴ , недавние метагеномные исследования выявили последовательности близкородственных SARS-подобных вирусов, циркулирующих в китайских популяциях летучих мышей, которые могут представлять угрозу в будущем ^1,6 .

Однако одни только данные о последовательности дают минимальную информацию для выявления и подготовки к будущим вирусам до пандемии. Поэтому, чтобы изучить потенциал возникновения (то есть потенциал заражения людей) циркулирующих CoV летучих мышей, мы создали химерный вирус, кодирующий новый зоонозный спайковый белок CoV — из последовательности RsSHC014-CoV, которая была выделена из китайских подковоносых летучих мышей 1 ^. — в контексте адаптированного к SARS-CoV позвоночника мыши. Гибридный вирус позволил нам оценить способность нового шиповидного белка вызывать заболевание независимо от других необходимых адаптивных мутаций в его природной основе.

Используя этот подход, мы охарактеризовали инфекцию CoV, опосредованную шиповидным белком SHC014, в первичных клетках дыхательных путей человека и in vivo , а также проверили эффективность доступных иммунных терапевтических средств против SHC014-CoV. Вместе стратегия переводит данные метагеномики, чтобы помочь прогнозировать появление новых вирусов и готовиться к ним.

Последовательности SHC014 и родственного RsWIV1-CoV показывают, что эти CoV являются ближайшими родственниками эпидемических штаммов SARS-CoV (рис. 1a,b); однако существуют важные различия в 14 остатках, которые связывают человеческий ACE2, рецептор SARS-CoV, включая пять, которые имеют решающее значение для диапазона хозяев: Y442, L472, N479, T487 и Y491 (ссылка 7).

В WIV1 три из этих остатков отличаются от эпидемического штамма SARS-CoV Urbani, но не ожидалось, что они изменят связывание с ACE2 (дополнительные рис. 1a, b и дополнительная таблица 1). Этот факт подтверждается как экспериментами по псевдотипированию, в которых измерялась способность лентивирусов, кодирующих шиповидные белки WIV1, проникать в клетки, экспрессирующие человеческий ACE2 (дополнительная рис. 1), так и анализами репликации WIV1-CoV in vitro (ссылка 1). Напротив, 7 из 14 остатков взаимодействия ACE2 в SHC014 отличаются от таковых в SARS-CoV, включая все пять остатков, критических для диапазона хозяев (дополнительный рис. 1c и дополнительная таблица 1).

Эти изменения в сочетании с неспособностью псевдотипированных лентивирусов, экспрессирующих шип SHC014, проникать в клетки (дополнительная рис. 1d), предполагают, что шип SHC014 не может связывать человеческий ACE2. Однако сообщалось, что аналогичные изменения в родственных штаммах SARS-CoV позволяют связывать ACE2 ^7,8 , что позволяет предположить, что для проверки требуется дополнительное функциональное тестирование.

Поэтому мы синтезировали шип SHC014 в контексте репликационно-компетентной, адаптированной к мышам основы SARS-CoV (здесь и далее мы будем называть химерный CoV SHC014-MA15), чтобы максимизировать возможность изучения патогенеза и вакцины на мышах (дополнительная рис. 2а). Несмотря на предсказания как структурного моделирования, так и экспериментов по псевдотипированию, SHC014-MA15 был жизнеспособным и реплицировался с высокими титрами в клетках Vero (дополнительная рис. 2b). Подобно SARS, SHC014-MA15 также требует функциональной молекулы ACE2 для проникновения и может использовать ортологи ACE2 человека, циветты и летучей мыши (дополнительная рис. 2c, d).

Чтобы проверить способность спайка SHC014 опосредовать инфекцию дыхательных путей человека, мы исследовали чувствительность линии эпителиальных клеток дыхательных путей человека Calu-3 2B4 (ссылка 9) к инфекции и обнаружили надежную репликацию SHC014-MA15, сравнимую с таковой у SARS-CoV Urbani (рис. 1с).

Чтобы расширить эти результаты, первичные культуры эпителия дыхательных путей человека (HAE) были инфицированы и показали устойчивую репликацию обоих вирусов (рис. 1d). В совокупности данные подтверждают способность вирусов с шипом SHC014 инфицировать клетки дыхательных путей человека и подчеркивают потенциальную угрозу межвидовой передачи SHC014-CoV.

Рисунок 1: SARS-подобные вирусы реплицируются в клетках дыхательных путей человека и вызывают патогенез in vivo .

( а ) Полноразмерные геномные последовательности репрезентативных CoV были выровнены и филогенетически картированы, как описано в онлайн-методах. Шкала шкалы представляет нуклеотидные замены, при этом помечается только бутстрап-поддержка выше 70%. На дереве показаны CoV, разделенные на три отдельные филогенетические группы, определяемые как α-CoV, β-CoV и γ-CoV. Классические кластеры подгрупп обозначены как 2a, 2b, 2c и 2d для β-CoV и как 1a и 1b для α-CoV. ( б ) Аминокислотные последовательности доменов S1 шипов репрезентативных β-CoV группы 2b, включая SARS-CoV, были выровнены и филогенетически картированы. Шкала шкалы представляет аминокислотные замены. ( в , г) Репликация вируса SARS-CoV Urbani (черный) и SHC014-MA15 (зеленый) после инфицирования клеток Calu-3 2B4 ( c ) или высокодифференцированных культур клеток HAE с первичным контактом воздух-жидкость ( d ) при множественном заражении (MOI) 0,01 для обоих типов клеток. Образцы собирали в отдельные моменты времени с биологическими повторами ( n = 3) как для экспериментов Calu-3, так и для экспериментов с HAE. ( e , f ) Потеря веса ( n = 9 для SARS-CoV MA15; n = 16 для SHC014-MA15) ( e ) и репликация вируса в легких ( n = 3 для SARS-CoV MA15; n = 4 для SHC014- МА15) ( ф) 10-недельных мышей BALB/c, инфицированных 1 × 10 ⁴ БОЕ адаптированного для мышей SARS-CoV MA15 (черный) или SHC014-MA15 (зеленый) интраназальным (внутри) путем. ( g, h ) Представлены репрезентативные изображения срезов легких, окрашенных на N-антиген SARS-CoV, от мышей, инфицированных SARS-CoV MA15 ( n = 3 мыши) ( g ) или SHC014-MA15 ( n = 4 мыши) ( h ). Для каждого графика центральное значение представляет среднее значение группы, а планки погрешностей определяют sem Масштабные линейки, 1 мм.

Полноразмерное изображение

Чтобы оценить роль спайка SHC014 в опосредовании инфекции in vivo , мы заразили 10-недельных мышей BALB/c 10 ⁴ бляшкообразующие единицы (БОЕ) либо SARS-MA15, либо SHC014-MA15 (рис. 1e–h). У животных, инфицированных SARS-MA15, наблюдалась быстрая потеря веса и летальность через 4 дня после заражения (dpi); Напротив, инфекция SHC014-MA15 вызывала значительную потерю веса (10%), но не приводила к летальному исходу у мышей (Fig. 1e). Исследование репликации вируса выявило почти эквивалентные титры вируса в легких мышей, инфицированных SARS-MA15 или SHC014-MA15 (рис. 1f). В то время как легкие мышей, инфицированных SARS-MA15, показали сильное окрашивание как терминальных бронхиол, так и легочной паренхимы при 2 днях на дюйм (рис. 1g), в легких мышей, инфицированных SHC014-MA15, наблюдалось снижение антигенного окрашивания дыхательных путей (рис. 1h); напротив, не наблюдалось дефицита антигенного окрашивания в паренхиме или в общей гистологической оценке,

Затем мы проанализировали инфекцию у более восприимчивых старых (12-месячных) животных. Животные, инфицированные SARS-MA15, быстро теряли вес и умирали от инфекции (дополнительная рис. 3a, b). Инфекция SHC014-MA15 вызывала сильную и устойчивую потерю веса, но имела минимальную летальность. Тенденции в гистологии и моделях окрашивания антигенов, которые мы наблюдали у молодых мышей, сохранялись у более старых животных (дополнительная таблица 3). Мы исключили возможность того, что SHC014-MA15 опосредует инфекцию через альтернативный рецептор, на основании экспериментов с использованием Ace2 ^-/- мышей, у которых не было потери веса или окрашивания антигеном после заражения SHC014-MA15 (дополнительные рис. 4a, b и дополнительная таблица 2). В совокупности данные показывают, что вирусы с шипом SHC014 способны вызывать потерю веса у мышей в контексте вирулентного остова CoV.

Учитывая доклиническую эффективность терапии моноклональными антителами против Эболы, такой как ZMAp ¹⁰ , мы затем попытались определить эффективность моноклональных антител SARS-CoV против инфекции SHC014-MA15. Ранее сообщалось о четырех широко нейтрализующих человеческих моноклональных антителах, нацеленных на спайковый белок SARS-CoV, и они являются вероятными реагентами для иммунотерапии ^11,12,13 . Мы изучили влияние этих антител на репликацию вируса (выраженное в виде процентного ингибирования репликации вируса) и обнаружили, что в то время как SARS-CoV Urbani дикого типа был сильно нейтрализован всеми четырьмя антителами при относительно низких концентрациях антител (рис. 2a–d), нейтрализация варьировалась для SHC014-MA15. Fm6, антитело, генерируемое фаговым дисплеем и ускользающими мутантами ^11,12, достигались только фоновые уровни ингибирования репликации SHC014-MA15 (рис. 2а). Точно так же антитела 230.15 и 227.14, которые были получены из В-клеток памяти пациентов, инфицированных SARS-CoV ¹³, также не удалось заблокировать репликацию SHC014-MA15 (рис. 2b, c). Для всех трех антител различия между шиповидными аминокислотными последовательностями SARS и SHC014 соответствовали прямым или соседним заменам остатков, обнаруженным у ускользающих мутантов SARS-CoV (fm6 N479R; 230,15 L443V; 227,14 K390Q/E), что, вероятно, объясняет отсутствие антител. Нейтрализующая активность против SHC014. Наконец, моноклональное антитело 109.8 было способно достичь 50% нейтрализации SHC014-MA15, но только при высоких концентрациях (10 мкг/мл) (рис. 2d). В совокупности результаты показывают, что широко нейтрализующие антитела против SARS-CoV могут иметь лишь незначительную эффективность против новых SARS-подобных штаммов CoV, таких как SHC014.

Рисунок 2: Моноклональные антитела против SARS-CoV обладают незначительной эффективностью против SARS-подобных CoV. фигура 2

( a - d ) Анализы нейтрализации, оценивающие эффективность (измеряемую как уменьшение количества бляшек) панели моноклональных антител, которые изначально были созданы против эпидемического SARS-CoV, против заражения клеток Vero SARS-CoV Urbani (черный ) или SHC014-MA15 (зеленый). Были протестированы антитела fm6 ( n = 3 для Urbani; n = 5 для SHC014-MA15) ^11,12 ( a ), 230,15 ( n = 3 для Urbani; n = 2 для SHC014-MA15) ( b ), 227,15 ( n = 3 для Urbani, n = 5 для SHC014-MA15) ( c ) и 109,8 ( n = 3 для Urbani; n = 2 для SHC014-MA15) ¹³ ( г ). Каждая точка данных представляет среднее значение группы, а планки погрешностей определяют sem. Обратите внимание, что планки погрешностей в клетках Vero, инфицированных SARS-CoV Urbani, в b , c перекрываются символами и не видны.

Полноразмерное изображение

Чтобы оценить эффективность существующих вакцин против инфекции SHC014-MA15, мы вакцинировали старых мышей двойным инактивированным цельным SARS-CoV (DIV). Предыдущая работа показала, что DIV может нейтрализовать и защищать молодых мышей от заражения гомологичным вирусом ¹⁴ ; однако вакцина не смогла защитить старых животных, у которых также наблюдалась усиленная иммунная патология, что указывает на возможность причинения вреда животным из-за вакцинации ¹⁵ . Здесь мы обнаружили, что DIV не обеспечивает защиты от заражения SHC014-MA15 в отношении потери веса или титра вируса (дополнительная рис. 5a, b). В соответствии с предыдущим отчетом с другими гетерологичными группами 2b CoV ¹⁵, сыворотка старых мышей, вакцинированных DIV, также не смогла нейтрализовать SHC014-MA15 (дополнительная рис. 5c).

Примечательно, что вакцинация DIV привела к сильной иммунной патологии (дополнительная таблица 4) и эозинофилии (дополнительная рис. 5d – f). В совокупности эти результаты подтверждают, что вакцина DIV не будет защищать от инфекции SHC014 и, возможно, может усилить заболевание в вакцинированной возрастной группе.

В отличие от вакцинации мышей DIV, использование SHC014-MA15 в качестве живой аттенуированной вакцины показало потенциальную перекрестную защиту от заражения SARS-CoV, но результаты имеют важные оговорки. Мы заразили молодых мышей 10 ⁴ pfu SHC014-MA15 и наблюдали за ними в течение 28 дней. Затем мы заразили мышей SARS-MA15 на 29-й день (дополнительная рис. 6a). Предшествующее заражение мышей высокой дозой SHC014-MA15 обеспечивало защиту от заражения летальной дозой SARS-MA15, хотя через 28 дней после заражения SHC014-MA15 наблюдался лишь минимальный ответ нейтрализации SARS-CoV от антисыворотки. Дополнительный рис. 6b, 1: 200). В отсутствие вторичной бустерной антигенной иммунизации 28 dpi представляет собой ожидаемый пик титров антител и означает, что со временем защита от SARS-CoV будет снижаться ^16,17.. Аналогичные результаты, демонстрирующие защиту от заражения смертельной дозой SARS-CoV, наблюдались у старых мышей BALB/c в отношении потери веса и репликации вируса (дополнительная рис. 6c, d). Однако инфекционная доза SHC014-MA15, равная 10 ⁴ БОЕ, вызывала > 10% потерю веса и летальность у некоторых старых животных (рис. 1 и дополнительная рис. 3). Мы обнаружили, что вакцинация более низкой дозой SHC014-MA15 (100 БОЕ) не вызывала потери веса, но также не защищала пожилых животных от смертельной дозы SARS-MA15 (дополнительная рис. 6e, f). В совокупности данные свидетельствуют о том, что заражение SHC014-MA15 может обеспечить перекрестную защиту от SARS-CoV за счет консервативных эпитопов, но необходимая доза индуцирует патогенез и исключает использование в качестве аттенуированной вакцины.

Установив, что шип SHC014 обладает способностью опосредовать инфицирование клеток человека и вызывать заболевание у мышей, мы затем синтезировали полноразмерный инфекционный клон SHC014-CoV на основе подхода, использованного для SARS-CoV (рис. 3a) ² . Репликация в клетках Vero не выявила дефицита SHC014-CoV по сравнению с SARS-CoV (рис. 3b); однако SHC014-CoV был значительно ( P <0,01) аттенуирован в первичных культурах HAE как через 24, так и через 48 часов после заражения (рис. 3c). В естественных условиях инфицирование мышей не показало значительной потери веса, но показало снижение репликации вируса в легких полноразмерной инфекции SHC014-CoV по сравнению с SARS-CoV Urbani (рис. 3d, e). В совокупности результаты подтверждают жизнеспособность полноразмерного SHC014-CoV, но предполагают, что требуется дальнейшая адаптация, чтобы его репликация была эквивалентна репликации эпидемического SARS-CoV в респираторных клетках человека и у мышей.

Рисунок 3: Полноразмерный SHC014-CoV реплицируется в дыхательных путях человека, но не обладает вирулентностью эпидемического SARS-CoV. цифра 3

( а ) Схема молекулярного клона SHC014-CoV, который был синтезирован в виде шести смежных кДНК (обозначенных SHC014A, SHC014B, SHC014C, SHC014D, SHC014E и SHC014F), фланкированных уникальными сайтами BglI, которые позволяли осуществлять направленную сборку полноразмерной кДНК, экспрессирующей открытые рамки считывания (для 1а, 1б, шипа, 3, оболочки, матрицы, 6–8 и нуклеокапсида). Подчеркнутые нуклеотиды представляют выступающие последовательности, образованные после расщепления рестрикционными ферментами. ( b , c ) Репликация вируса SARS-CoV Urbani (черный) или SHC014-CoV (зеленый) после инфицирования клеток Vero ( b ) или хорошо дифференцированных культур клеток HAE с первичным интерфейсом воздух-жидкость ( c) при МВД 0,01. Образцы собирали в отдельные моменты времени с биологическими повторами ( n = 3) для каждой группы. Данные представляют собой один эксперимент для клеток Vero и HAE. ( d , e ) Потеря веса ( n = 3 для SARS-CoV MA15, n = 7 для SHC014-CoV; n = 6 для SARS-Urbani) ( d ) и репликация вируса в легких ( n = 3 для SARS-Urbani и SHC014-CoV) ( e ) 10-недельных мышей BALB/c, инфицированных 1 × 10 ⁵ БОЕ SARS-CoV MA15 (серый), SHC014-CoV (зеленый) или SARS-CoV Urbani (черный) через в пути. Каждая точка данных представляет среднее значение группы, а планки погрешностей определяют sem **P <0,01 и *** P <0,001 с использованием двустороннего критерия Стьюдента для отдельных моментов времени.

Во время эпидемии SARS-CoV были быстро установлены связи между пальмовыми циветтами и штаммами CoV, обнаруженными у людей ⁴ .

Основываясь на этом открытии, общая парадигма появления утверждает, что эпидемический SARS-CoV возник как вирус летучих мышей, перешел к циветтам и включил изменения в рецептор-связывающий домен (RBD) для улучшения связывания с Ace2 циветты (ссылка 18).

Последующее воздействие на людей на рынках живых животных позволило заразить человека штаммом циветты, которая, в свою очередь, адаптировалась и стала эпидемическим штаммом (рис. 4а).

Тем не менее, филогенетический анализ показывает, что ранние штаммы SARS человека более тесно связаны со штаммами летучих мышей, чем со штаммами циветт ¹⁸ .

Следовательно, вторая парадигма утверждает, что прямая передача от летучих мышей человеку инициировала появление SARS-CoV и что пальмовые циветты служили вторичным хозяином и резервуаром для продолжающейся инфекции (рис. 4b) ¹⁹ . Для обеих парадигм адаптация спайков у вторичного хозяина рассматривается как необходимость, при этом ожидается, что большинство мутаций произойдет в RBD, тем самым способствуя улучшению инфекции. Обе теории подразумевают, что пулы CoV летучих мышей ограничены, а мутации диапазона хозяев являются случайными и редкими, что снижает вероятность будущих событий появления у людей.

Рисунок 4: Парадигмы появления коронавирусов. цифра4

Штаммы коронавируса сохраняются в пулах квазивидов, циркулирующих в популяциях летучих мышей. ( a , b ) Традиционные теории возникновения SARS-CoV утверждают, что мутанты диапазона хозяев (красный кружок) представляют собой случайные и редкие случаи, которые допускают заражение альтернативных хозяев. Парадигма вторичного хозяина ( а ) утверждает, что нечеловек-хозяин инфицирован вирусом-предшественником летучей мыши и благодаря адаптации облегчает передачу вируса человеку; последующая репликация в организме человека приводит к эпидемическому вирусному штамму. Прямая парадигма ( б) предполагает, что передача происходит между летучими мышами и людьми без необходимости наличия промежуточного хозяина; затем происходит отбор в человеческой популяции с близкородственными вирусами, реплицирующими во вторичном хозяине, что обеспечивает сохранение вирусной персистенции и адаптации у обоих. ( c ) Данные по химерным SARS-подобным вирусам доказывают, что пулы квазивидов содержат несколько вирусов, способных инфицировать клетки человека без необходимости мутаций (красные кружки). Хотя для возникновения эпидемии может потребоваться адаптация во вторичных или человеческих хозяевах, если вирусы, содержащие шип SHC014, рекомбинируют с вирулентными остовами CoV (кружки с зеленым контуром), то результатом может быть эпидемическое заболевание у людей. Существующие данные поддерживают элементы всех трех парадигм.

Полноразмерное изображение

Хотя наше исследование не опровергает другие пути появления, оно свидетельствует в пользу третьей парадигмы, в которой циркулирующие пулы CoV летучих мышей поддерживают «уравновешенные» шиповидные белки, которые способны заражать людей без мутации или адаптации (рис. 4c). Эта гипотеза иллюстрируется способностью химерного вируса, содержащего шип SHC014 в остове SARS-CoV, вызывать сильную инфекцию как в культурах дыхательных путей человека, так и у мышей без адаптации RBD.

В сочетании с наблюдением за ранее идентифицированными патогенными остовами CoV ^3,20 наши результаты показывают, что исходные материалы, необходимые для новых штаммов, подобных SARS, в настоящее время циркулируют в животных резервуарах. Примечательно, что хотя полноразмерный SHC014-CoV, вероятно, требует дополнительной адаптации позвоночника для опосредования заболевания человека, задокументированные случаи высокочастотной рекомбинации в семействах CoV подчеркивают возможность появления в будущем и необходимость дальнейшей подготовки.

На сегодняшний день геномные скрининги популяций животных в основном использовались для выявления новых вирусов в условиях вспышек ²¹ . Предлагаемый здесь подход расширяет эти наборы данных для изучения вопросов появления вирусов и терапевтической эффективности. Мы считаем вирусы с шипом SHC014 потенциальной угрозой из-за их способности размножаться в первичных культурах дыхательных путей человека, наилучшей доступной модели заболеваний человека. Кроме того, наблюдаемый патогенез у мышей указывает на способность вирусов, содержащих SHC014, вызывать заболевание на моделях млекопитающих без адаптации RBD.

Примечательно, что дифференциальный тропизм в легких по сравнению с SARS-MA15 и аттенуация полноразмерного SHC014-CoV в культурах HAE по сравнению с SARS-CoV Urbani позволяют предположить, что факторы, помимо связывания ACE2, включая процессивность спайков, биодоступность рецепторов или антагонизм иммунных ответов хозяина — могут способствовать возникновению. Однако необходимы дальнейшие испытания на нечеловеческих приматах, чтобы перевести эти результаты в патогенный потенциал у людей.

Важно отметить, что неэффективность доступных терапевтических средств определяет острую потребность в дальнейших исследованиях и разработке методов лечения. Обладая этими знаниями, можно создавать программы наблюдения, диагностические реагенты и эффективные методы лечения, которые защищают от появления CoV, специфичных для группы 2b, таких как SHC014, и их можно применять к другим ветвям CoV, которые поддерживают аналогичные гетерогенные пулы.

В дополнение к предложению подготовки против будущих новых вирусов, этот подход следует рассматривать в контексте санкционированной правительством США паузы в исследованиях усиления функции (GOF) ²² .

На основе предыдущих моделей возникновения (рис. 4а, б) не ожидалось, что создание химерных вирусов, таких как SHC014-MA15, повысит патогенность. Хотя SHC014-MA15 является аттенуированным по сравнению с его родительским SARS-CoV, адаптированным к мышам, аналогичные исследования по изучению патогенности CoV с шипом Urbani дикого типа в остове MA15 не показали потери веса у мышей и снижения репликации вируса ²³ . Таким образом, по сравнению с CoV шипа Urbani-MA15, SHC014-MA15 снова проявляется в патогенезе (рис. 1).

На основании этих выводов группа научных обзоров может счесть аналогичные исследования по созданию химерных вирусов на основе циркулирующих штаммов слишком рискованными, поскольку нельзя исключать повышенную патогенность на моделях млекопитающих.

В сочетании с ограничениями на штаммы, адаптированные к мышам, и разработкой моноклональных антител с использованием ускользающих мутантов исследования появления CoV и терапевтической эффективности могут быть серьезно ограничены в будущем. Вместе эти данные и ограничения представляют собой перекресток исследовательских интересов GOF; потенциал подготовки к будущим вспышкам и смягчения их последствий необходимо сопоставлять с риском создания более опасных патогенов. При разработке политики в будущем важно учитывать ценность данных, полученных в результате этих исследований, и то, требуют ли эти типы исследований химерных вирусов дальнейшего изучения по сравнению с сопутствующими рисками.

В целом, наш подход использовал данные метагеномики для выявления потенциальной угрозы, которую представляет циркулирующий SARS-подобный CoV летучих мышей SHC014. Из-за способности химерных вирусов SHC014 реплицироваться в культурах дыхательных путей человека, вызывать патогенез in vivo и ускользать от современных терапевтических средств, существует необходимость как в наблюдении, так и в улучшенных терапевтических средствах против циркулирующих SARS-подобных вирусов. Наш подход также позволяет использовать данные метагеномики для прогнозирования появления вирусов и применения этих знаний при подготовке к лечению будущих новых вирусных инфекций.

Методы

Вирусы, клетки, инфекции in vitro и анализы налета

SARS-CoV дикого типа (Urbani), адаптированный к мышам SARS-CoV (MA15) и химерные SARS-подобные CoV культивировали на клетках Vero E6 (полученных из Медицинского научно-исследовательского института инфекционных болезней армии США), выращенных в модифицированной Дульбекко среде Игла. среда (DMEM) (Gibco, Калифорния) и 5% сыворотка эмбрионального клона (FCS) (Hyclone, Южный Логан, Юта) вместе с антибиотиком/антимикотиком (Gibco, Карлсбад, Калифорния). Клетки DBT (лаборатория Baric, источник неизвестен), экспрессирующие ортологи ACE2, ранее были описаны как для человека, так и для циветты; Последовательность bat Ace2 была основана на последовательности Rhinolophus leschenaulti , и клетки DBT, экспрессирующие bat Ace2, были установлены, как описано ранее ⁸ .

Эксперименты по псевдотипированию были аналогичны экспериментам с использованием псевдовируса на основе ВИЧ, приготовленного, как описано ранее ¹⁰ , и исследованы на клетках HeLa (Wuhan Institute of Virology), которые экспрессировали ортологи ACE2 . Клетки HeLa выращивали в минимально необходимой среде (MEM) (Gibco, CA) с добавлением 10% FCS (Gibco, CA), как описано ранее ²⁴ .

Кривые роста в Vero E6, DBT, Calu-3 2B4 и первичных эпителиальных клетках дыхательных путей человека были выполнены, как описано ранее ^8,25 . В последнее время ни один из штаммов рабочих клеточных линий не был аутентифицирован или протестирован на наличие микоплазмы, хотя оригинальные исходные штаммы, использованные для создания рабочих штаммов, не содержат контаминации. Человеческие легкие для культур НАО были закуплены в соответствии с протоколами, утвержденными Институциональным наблюдательным советом Университета Северной Каролины в Чапел-Хилл. Культуры НАО представляют собой высокодифференцированный эпителий дыхательных путей человека, содержащий реснитчатые и нереснитчатые эпителиальные клетки, а также бокаловидные клетки. Культуры также выращивают на поверхности раздела воздух-жидкость в течение нескольких недель перед использованием, как описано ранее ²⁶ .

Вкратце, клетки промывали PBS и инокулировали вирусом или имитировали разведение в PBS в течение 40 минут при 37 °C. После инокуляции клетки промывали три раза и добавляли свежую среду для обозначения времени «0». В каждый описанный момент времени собирали три или более биологических повторов. В каких-либо коллекциях образцов не использовалось ослепление, и образцы не были рандомизированы. Все культивирование вируса проводилось в лаборатории уровня биологической безопасности (BSL) 3 с резервными вентиляторами в боксах биологической безопасности, как описано ранее нашей группой ² . Весь персонал был в респираторах с принудительной подачей воздуха (Breathe Easy, 3M), костюмах Tyvek, фартуках и ботинках, а также в двойных перчатках.

Кластеризация последовательностей и структурное моделирование.

Полноразмерные геномные последовательности и аминокислотные последовательности доменов S1 шипа репрезентативных CoV были загружены из Genbank или Центра интеграции ресурсов Pathosystems (PATRIC), сопоставлены с ClustalX и филогенетически сопоставлены с использованием оценки максимального правдоподобия с использованием 100 бутстрепов или с помощью с помощью пакета PhyML соответственно. Дерево было сгенерировано с использованием максимального правдоподобия с помощью пакета PhyML. Шкала шкалы представляет нуклеотидные замены. Помечены только узлы с поддержкой начальной загрузки выше 70%.

Дерево показывает, что CoV делятся на три отдельные филогенетические группы, определяемые как α-CoV, β-CoV и γ-CoV. Классические кластеры подгрупп обозначены как 2a, 2b, 2c и 2d для β-CoV и 1a и 1b для α-CoV. Структурные модели были созданы с использованием Modeller (инструментарий биоинформатики Института Макса Планка) для создания моделей гомологии для SHC014 и Rs3367 RBD SARS в комплексе с ACE2 на основе кристаллической структуры 2AJF (банк данных белков). Модели гомологии визуализировали и обрабатывали в MacPyMol (версия 1.3).

Конструирование SARS-подобных химерных вирусов.

Как вирусы дикого типа, так и химерные вирусы были получены либо из SARS-CoV Urbani, либо из соответствующего адаптированного к мышам (SARS-CoV MA15) инфекционного клона (ic), как описано ранее ²⁷ .

Плазмиды, содержащие спайковые последовательности для SHC014, экстрагировали рестрикционным расщеплением и лигировали в плазмиду E и F инфекционного клона MA15. Клон был разработан и приобретен у Bio Basic в виде шести смежных кДНК с использованием опубликованных последовательностей, фланкированных уникальными сайтами рестрикционных эндонуклеаз класса II (BglI). После этого плазмиды, содержащие фрагменты генома дикого типа, химерного SARS-CoV и SHC014-CoV, амплифицировали, вырезали, лигировали и очищали.

Затем проводили реакции транскрипции in vitro для синтеза полноразмерной геномной РНК, которую трансфицировали в клетки Vero E6, как описано ранее ² . Среду из трансфицированных клеток собирали и использовали в качестве посевного материала для последующих экспериментов. Химерные и полноразмерные вирусы были подтверждены анализом последовательности перед использованием в этих исследованиях. Синтетическая конструкция химерного мутанта и полноразмерного SHC014-CoV была одобрена Институциональным комитетом по биобезопасности Университета Северной Каролины и Комитетом по исследованиям двойного назначения.

Заявление об этике

Это исследование было проведено в соответствии с рекомендациями по уходу и использованию животных Управления по защите лабораторных животных (OLAW), NIH. Институциональный комитет по уходу за животными и их использованию (IACUC) Университета Северной Каролины в Чапел-Хилл (UNC, номер разрешения A-3410-01) одобрил протокол исследования на животных (IACUC № 13-033), используемый в этих исследованиях.

Мыши и инфекция in vivo

Самок мышей BALB/cAnNHsD в возрасте 10 недель и 12 месяцев заказывали в Harlan Laboratories. Инфицирование мышей проводили, как описано ранее ²⁰ . Вкратце, животных доставляли в лабораторию BSL3 и давали им акклиматизироваться в течение 1 недели перед заражением. Для заражения и вакцинации живым аттенуированным вирусом мышей анестезировали смесью кетамина и ксилазина и инфицировали интраназально, при заражении, 50 мкл фосфатно-солевого буфера (PBS) или разбавленного вируса с тремя или четырьмя мышами в момент времени, в группы инфекции на дозу, как описано в подписях к фигурам.

Для отдельных мышей обозначения инфекции, включая невозможность вдыхания всей дозы, попадание инокулята из носа или заражение через рот, могли привести к исключению данных о мышах по усмотрению исследователя; после инфицирования, другие заранее установленные критерии исключения или включения не определены. Ни в одном эксперименте на животных не применяли ослепление, и животные не были рандомизированы. Для вакцинации молодых и старых мышей вакцинировали путем инъекции в подушечку лапы объемом 20 мкл либо 0,2 мкг дважды инактивированной вакцины против SARS-CoV с квасцами, либо имитацией PBS; мышам затем повторно вводили ту же схему через 22 дня и заражали через 21 день после этого.

Во всех группах, согласно протоколу, за животными ежедневно наблюдали клинические признаки заболевания (горбатость, взъерошенность шерсти и снижение активности) на протяжении всего эксперимента. Потеря веса отслеживалась ежедневно в течение первых 7 дней, после чего мониторинг веса продолжался до тех пор, пока животные не восстановили свой первоначальный вес или не демонстрировали непрерывное увеличение веса в течение 3 дней.

Всех мышей, которые потеряли более 20% от их исходной массы тела, кормили наземным кормом и далее контролировали несколько раз в день, пока они не превышали 20% отсечки. Мышей, потерявших более 30% исходной массы тела, немедленно умерщвляли в соответствии с протоколом. Любая мышь, считавшаяся умирающей или вряд ли выздоровевшей, также гуманно умерщвлялась по усмотрению исследователя. Эвтаназия была проведена с использованием передозировки изофлюрана, и смерть была подтверждена смещением шейного отдела позвоночника. Все исследования на мышах проводились в Университете Северной Каролины (№ A3410-01 по обеспечению благополучия животных) с использованием протоколов, одобренных Институциональным комитетом по уходу и использованию животных UNC (IACUC).

Гистологический анализ.

Левое легкое удаляли и погружали в 10% забуференный формалин (Фишер) без надувания на 1 неделю. Ткани заливали парафином, и срезы толщиной 5 мкм готовили в основном центре гистопатологии Комплексного онкологического центра UNC Lineberger. Чтобы определить степень антигенного окрашивания, срезы окрашивали на вирусный антиген с использованием коммерчески доступных поликлональных антител против нуклеокапсида SARS-CoV (Imgenex) и слепым методом оценивали окрашивание дыхательных путей и паренхимы, как описано ранее ²⁰ . Изображения были получены с использованием микроскопа Olympus BX41 с камерой Olympus DP71.

Анализы нейтрализации вирусов.

Анализы титра нейтрализации уменьшения зубного налета проводились с ранее охарактеризованными антителами против SARS-CoV, как описано ранее ^11,

12,13

. Вкратце, нейтрализующие антитела или сыворотку серийно разводили в два раза и инкубировали со 100 БОЕ различных инфекционных клонов, штаммов SARS-CoV, в течение 1 часа при 37 °C. Затем вирус и антитела добавляли в 6-луночный планшет с 5 × 10 ⁵ клеток Vero E6 на лунку в нескольких повторах ( n ≥ 2). После 1-часовой инкубации при 37 °С на клетки наносили 3 мл 0,8% агарозной среды. Планшеты инкубировали в течение 2 дней при 37°С, окрашивали нейтральным красным в течение 3 часов и подсчитывали бляшки. Процент уменьшения бляшек рассчитывали как (1 - (количество бляшек с антителами/количество бляшек без антител)) × 100.

статистический анализ

Все эксперименты проводились с контрастированием двух экспериментальных групп (либо двух вирусов, либо вакцинированных и невакцинированных когорт). Следовательно, значительные различия в титре вируса и гистологической оценке определяли с помощью двустороннего критерия Стьюдента в отдельные моменты времени. Данные были нормально распределены в каждой сравниваемой группе и имели одинаковую дисперсию.

Биобезопасность и биозащита

Сообщенные исследования были начаты после того, как Комитет по институциональной биобезопасности Университета Северной Каролины одобрил экспериментальный протокол (название проекта: Создание инфекционных клонов SARS-подобных CoV летучих мышей; идентификатор плана безопасности лаборатории: 20145741; идентификатор графика G: 12279).

Эти исследования были начаты до того, как правительство США приостановило финансирование исследований в рамках совещательного процесса для отдельных исследований по расширению функциональности, связанных с вирусами гриппа, MERS и SARS . Этот документ был рассмотрен финансирующим агентством, NIH. Было запрошено продолжение этих исследований, и это было одобрено NIH.

SARS-CoV является избранным агентом. Вся работа по этим исследованиям проводилась в соответствии с утвержденными стандартными операционными процедурами (СОП) и условиями безопасности для SARS-CoV, MERs-CoV и других связанных CoV. Наши институциональные объекты CoV BSL3 были спроектированы в соответствии с требованиями безопасности, рекомендованными в Биобезопасности в микробиологических и биомедицинских лабораториях (BMBL), Министерством здравоохранения и социальных служб США, Службой общественного здравоохранения, Центрами по контролю за заболеваниями (CDC). ) и НИЗ. Планы безопасности лаборатории были представлены, и объект был одобрен для использования Департаментом охраны окружающей среды и безопасности (EHS) UNC и CDC. Для входа на объект необходима электронная карта доступа.

Все работники прошли обучение в EHS по безопасному использованию респираторов для очистки воздуха с электроприводом (PAPR), и у них имеются соответствующие рабочие привычки на объекте BSL3 и планы активного медицинского наблюдения. Наши объекты CoV BSL3 оснащены резервными вентиляторами, аварийным питанием для вентиляторов, шкафами биологической безопасности и морозильными камерами, а также на наших объектах можно разместить стойки для мышей SealSafe. Материалы, классифицированные как агенты BSL3, включают SARS-CoV, штаммы-предшественники CoV летучих мышей, MERS-CoV и мутанты, полученные из этих патогенов. На объектах BSL3 эксперименты с инфекционным вирусом проводятся в сертифицированном боксе биобезопасности класса II (BSC).

Все сотрудники носят халаты, костюмы и фартуки Tyvek, PAPR и бахилы, а на руках у них двойные перчатки. Пользователи BSL3 подлежат плану медицинского наблюдения, контролируемому Университетской клиникой гигиены труда (UEOHC), который включает ежегодную физическую, ежегодную вакцинацию против гриппа и обязательное сообщение о любых симптомах, связанных с инфекцией CoV, в периоды работы в BSL3. Все пользователи BSL3 обучены управлению рисками и протоколам отчетности, готовы к самостоятельному карантину и обучены безопасной доставке в местный отдел по борьбе с инфекционными заболеваниями в чрезвычайной ситуации. Обо всех случаях потенциального воздействия сообщают и расследуют EHS и UEOHC, а отчеты направляются как в CDC, так и в NIH.

Коды доступа