Предыстория: Инъекции COVID-19 на основе РНК BNT162b2 предназначены для трансфекции клеток человека с целью эффективного производства белков-шипов для иммунного ответа.
Методы: Мы проанализировали четыре немецкие партии BNT162b2, применив культуру клеток HEK293, иммуногистохимию, ИФА, ПЦР и масс-спектрометрию.
Результаты: Мы демонстрируем успешную трансфекцию модифицированных нуклеозидами биологических препаратов мРНК (модРНК) в клетки HEK293 и демонстрируем устойчивые уровни белков-шипов в течение нескольких дней культивирования клеток. Секреция в клеточные супернатанты происходила преимущественно через внеклеточные везикулы, обогащенные экзосомными маркерами. Далее мы проанализировали содержание РНК и ДНК в этих флаконах и идентифицировали большие количества ДНК после расщепления РНКазой А во всех партиях с концентрациями в диапазоне от 32,7 нг до 43,4 нг на клиническую дозу. Это намного превышает максимально допустимую концентрацию в 10 нг на клиническую дозу, установленную международными регулирующими органами. Анализ генов с использованием выбранных пар праймеров для ПЦР показал, что остаточная ДНК представляет собой не только фрагменты матриц ДНК, кодирующих ген спайка, но и все гены плазмиды, включая промотор/энхансер SV40 и ген устойчивости к антибиотикам.
Вывод: Наши результаты вызывают серьезную обеспокоенность по поводу безопасности вакцины BNT162b2 и призывают к немедленной остановке всех биологических препаратов РНК, если эти опасения не будут развеяны.
Ключевые слова
Введение
В 2020 году политически продвигаемые кампании, такие как “Operation Warp Speed” [1,2] и “Project Lightspeed” [3,4], подтолкнули к разработке совершенно нового класса лекарств, наконец, направленного на вакцинацию семи миллиардов человек во всем мире против COVID-19 [5]. Эти так называемые “мРНК-вакцины” –, называемые в дальнейшем инъекциями РНК или биологическими РНК –, состоят из модифицированной нуклеозидами мРНК (модРНК), упакованной в компетентные к трансфекции липидные наночастицы (LNP). Согласно основной идее, модРНК, попав в клетку, заставляет эту клетку продуцировать белки-шипы SARS-CoV-2 и представлять ее на поверхности клетки, что впоследствии приводит к стимуляции иммунной системы для генерации специфических антител против представленного шипа. антиген [6,7]. “скорость science” [8] и спрос правительств во всем мире столкнулись с проблемой производства больших количеств модРНК в течение очень короткого времени. Таким образом, первоначальный процесс создания матриц ДНК (процесс-1) для производства модРНК на основе ПЦР, получивший разрешение на использование в клиническом исследовании фазы 3, очень скоро достиг своих пределов. Затем компании перешли на крупномасштабное производство матриц ДНК с помощью клонированных челночных векторов, которые можно легко размножать в системах культивирования бактериальных клеток (процесс-2) [9]. Начиная с внедрения правительственной вакцины, этот продукт процесса 2 использовался вместо исходного продукта.
Уже в 2021 году сообщалось, что шиповые белки, индуцированные модРНК, могут циркулировать в крови вакцинированных через несколько недель после инъекций [10]. В 2022 году первое детальное патологоанатомическое исследование выявило наличие индуцированных вакциной шиповых белков в нескольких местах стенок сосудов и различных тканей через несколько недель после последней инъекции BNT162b2 [11]. Недавно индуцированные вакциной шиповые белки были идентифицированы в плацентах женщин, которым вводили РНК-биологические препараты во время беременности [12]. Дхули и его коллеги сообщили о наличии последовательности, соответствующей фрагменту модРНК, в клетках крови пациентов с длительным COVID с двумя дозами вакцины BioNTech/Pfizer в анамнезе [13]. Важно отметить, что производство белков-шипов клетками организма не ограничивается зоной инъекции и не прекращается в течение нескольких дней, как было заявлено производителями и ответственными органами. На данный момент предложено несколько механизмов, которые могут способствовать замечательной долгосрочной экспрессии белков-шипов у вакцинированных лиц.
Во-первых, биологические препараты содержат модифицированную нуклеозидами мРНК (модРНК) для продления ее срока службы [14], уменьшения ее разрушения путем отключения обнаружения толл-подобных рецепторов [15] и максимизации ее трансляции. Это было достигнуто за счет замены природных уридинов синтетическими N1-метилпсевдоуридинами (мПси) и увеличения содержания гуанина и цитозина (известного как оптимизация кодонов) [6,14,16].
Second, transfected modRNA may be reverse transcribed into DNA and integrated into the cell´s genome via a LINE1 (Long Interspersed Nuclear Element-1) mediated mechanism, as data from transfection experiments in human cell lines HEK293T [17] and Huh7 [18] suggested.
Third, lipid nanoparticles (LNP) delivering modRNA to the cells may also contain DNA, which originated from the production process, where spike-coding DNA was used as a template for the in-vitro transcription of modRNA. Remaining DNA may not completely be separated from modRNA and degraded by deoxyribonuclease-I (DNase-I) digestion and, subsequently, be packaged in the LNP together with the modRNA. It is well known that DNase-I can adhere to the surfaces of reaction vessels and can exhibit reduced efficiency in the presence of hybrids of DNA and RNA [19]. According to a manufacturer, it is “probably impossible to remove every single strand of DNA in an RNA preparation” [20]. Given the fact that the European Medicines Agency and the German Paul Ehrlich Institute fixed a residual DNA of 10 ng per injected clinical dose as acceptable (and indeed DNA up to this margin was shown in the registration documents [9]), it makes a packaging of this DNA into the lipid nanoparticles highly likely.
Такая возможность появилась на сцене в феврале 2023 года, когда МакКернан и его коллеги объявили об открытии больших количеств как ДНК, кодирующей спайк, так и остаточной плазмидной ДНК, полученной из системы векторов экспрессии в партиях вакцин BioNTech/Pfizer и Moderna [21,22]. Основная часть была представлена фрагментированной линеаризованной ДНК, а также интактными плазмидами, способными успешно трансфицировать клетки E. coli [21,22]. Предполагая, что эти интактные плазмиды были упакованы в LNP вместе с модРНК, стабильные векторы экспрессии могут проникать в клетки и, таким образом, обеспечивать богатый источник длительного производства шипов в случае, если клетки способны транскрибировать кодированную область шипов. Непостижимо, что плазмиды BioNTech/Pfizer, но не Moderna, содержат не только бактериальную промоторную систему Т7, но и последовательность промотора/энхансера обезьяньего вируса 40 (SV40) млекопитающих [23-25]. Это дает повод для беспокойства, поскольку уже в 1999 году Дин и его коллеги продемонстрировали, что проникновение плазмидной ДНК в ядро, особенно в неделящиеся клетки, требует последовательности промотора/энхансера SV40 длиной 72 п.н. [23]. Следует отметить, что ни промотор, ни источник репликации не нужны для ядерной локализации плазмидной ДНК [23]. Между тем, результаты команды МакКернана подтверждены и продлены [26]. Недавно Кёниг и Киршнер опубликовали данные о больших количествах остаточной ДНК в пределах нескольких лотов BNT162b2 [27].
На этом фоне мы провели серию экспериментов, чтобы ответить на следующие актуальные вопросы. Во-первых, может ли большое количество остаточной ДНК в партиях BioNTech [27] и даже плазмидах, идентифицированных в партиях Pfizer [21,22], быть подтверждено только партиями BioNTech (BNT162b2, Comirnaty), распространенными в Германии, с помощью различных сопоставимых методов обнаружения ДНК? Во-вторых, можно ли эффективно трансфицировать остаточные плазмиды или фрагменты ДНК, если они присутствуют, в клетки человека вместе с кодирующей модРНК? В-третьих, могут ли эти биологические препараты индуцировать продолжающуюся клеточную экспрессию белка-шипа, создавая тем самым долгосрочные очаги иммунной атаки? Чтобы ответить на эти вопросы, мы применили модель культуры клеток in vitro с использованием клеток HEK293, поскольку эти клетки имитируют делящиеся клетки человека и, следовательно, являются не только подходящей мишенью для продукции белка, но также наиболее восприимчивы к потенциальному взаимодействию трансфицированных клеток. чужеродные нуклеиновые кислоты и геном клетки. Тот факт, что мы получили положительные результаты по всем вопросам, вызывает наибольшую обеспокоенность по поводу безопасности вакцины BNT162b2.
Материалы и методы
Лоты вакцин
Использовали следующие оригинальные и неоткрытые партии вакцины BNT162b2: FD7958 (моновалентный Ухань; срок годности октябрь 2021 г.), FE6975 (моновалентный Ухань; срок годности октябрь 2021 г.), EX8679 (моновалентный Ухань; срок годности август 2021 г.), HD9869 (двухвалентный Ухань/Омикрон XBB1.5; срок годности октябрь 2024 г.). В качестве положительного контроля реакции ПЦР и масс-спектрометрического анализа использовалась партия GH9715 (двухвалентные Wuhan/Omicron BA.4 и BA.5; срок годности июнь 2023 г.), поскольку ее загрязнение плазмидой, содержащей SV40, было доказано уже [25]. Флаконы нам предоставила аптека в охлажденном состоянии производителя. Они не открывались и всегда охлаждались во время транспортировки и хранения.
Эксперименты с клеточной линией и ИФА
Клетки HEK293 выращивали во влажном инкубаторе при 37 °C, 5% CO2. Используемые клетки были из исходных запасов (Cell Lines Service GmbH, Эппенхайм, Германия), которые регулярно давали отрицательный результат на микоплазму и хранились в аликвотах в жидком азоте. Клетки размораживали свежими перед экспериментами по трансфекции, культивировали в чашках с лунками диаметром 10 см с DMEM с 10% фетальной телячьей сывороткой, дополненной 1% пенициллином/стрептомицином, до слияния и переносили после трипсинизации (0,05% трипсин/ЭДТА (Gibco #11500636) 3 мин. 37 °C) в новые лунки в соответствии с экспериментальной установкой, описанной ниже.
По данным производителя, для всех экспериментов по трансфекции флаконы с одновалентной мРНК предварительно разбавляли 1:5 стерильным фосфатно-солевым буфером, не содержащим РНКазы (PBS), до клинической концентрации. Двухвалентные флаконы предварительно не разводились, поскольку клиническая концентрация уже присутствовала. Для ELISA 12-луночные планшеты с плотностью клеток 80% и средним объемом 1 мл каждый трансфицировали 1/12 (25 мкл) клинической дозы флакона, а клетки и среду собирали в моменты времени на 1-й день, день. 3, день 5 и день 7. Нетрансфицированные клетки на 7-й день служили отрицательным контролем. Для анализа белка клетки дважды промывали стерильным фосфатно-солевым буфером (PBS) после соответствующего времени инкубации (см. выше), лизировали в лизирующем буфере (25 мМ Трис, 150 мМ NaCl, 1% Тритон-Х-100, 1% НП40, pH 7,6) и уровень белка-шипа определяли в белковом супернатанте и среде с использованием коммерчески доступного высокочувствительного анализа S-Plex SARS-CoV-2 Spike ELISA (Mesoscale Discovery K150ADJS).
Иммуногистохимия
Иммуногистохимию проводили по стандартному протоколу. Короче говоря, 60% плотных клеток на 24-луночных планшетах трансфицировали 12,5 мкл клинической дозы на лунку в 200 мкл среды. После 4h инкубации клетки дважды промывали стерильным PBS и на лунки наносили 500 мкл свежей среды для выращивания. 24h после начала трансфекции клетки собирали, фиксировали в 4% забуференном параформальдегиде, внедряли в 2% агарозу/воду и обезвоживали с использованием стандартного протокола дегидратации для образцов биопсии. После этого агарозные блоки заливали в парафин и разрезали. Срезы помещали на предметные стекла Superfrost, дважды депарафинировали ксилолом и регидратировали в ступенчатой серии этанола и в дистиллированной воде. После регидратации и извлечения антигена (ACD biotechne #322000, 15-минутный пароход) предметные стекла пермеабилизировали (0,3% Triton-X-100/PBST), обрабатывали супрессором пероксида (Thermo Scientific #35000) и блокировали в PBS с помощью 1% козьей сыворотки, 1% БСА, 0,1% Triton-X-100 и 0,05% Tween-20. Затем предметные стекла инкубировали с кроличьим поликлональным антителом против шипового белка SARS-CoV-2 (субъединица S1; ProSci #9083) в течение ночи при 4 °C, промывали PBS и инкубировали с антикроличьим поли-HRP-антителом (Invitrogen). #32260) в течение 30 мин при комнатной температуре. Обнаружение белка осуществляли с использованием постоянного зеленого набора HRP (Zytomed), контрастированного гематоксилином и встроенного в набор RotiHistol II.
Количественная оценка ДНК и РНК
Одну клиническую дозу каждого флакона разбавляли 1:10 стерильным PBS, не содержащим РНКазы, с добавлением 1% Triton-X-100. Для количественного определения РНК 10 мкл разведенной клинической дозы наносили на черный 96-луночный планшет в трех экземплярах и обрабатывали анализом высокой чувствительности РНК Qubit (Invitrogen #Q32852). Для количественного определения дцДНК 10 мкл разведенной клинической дозы наносили на черный 96-луночный планшет в трех экземплярах и обрабатывали высокочувствительным анализом дцДНК Qubit (Invitrogen #Q33230), анализом дцДНК Quanti-iT Pico Green (Invitrogen #P7589). или анализ дцДНК AccuBlue высокой чувствительности (Biotium #31006-T). Обработку РНКазой А (конечная концентрация 50 мкг/мл, не содержащая ДНКазы монарх-РНКаза А #T3018L) проводили при 37 °C в течение 30 мин. Сигналы всех анализов определяли количественно с помощью стандартного планшет-ридера при возбуждении 483 нм и излучении 530 нм. Для соответствующих флуорофоров, используемых в наборах, не было перекрытия сигналов между длинами волн возбуждения и излучения. Мы измерили количество ДНК и РНК (рис. 1 AC) и рассчитали соотношение ДНК/РНК относительно 1 мг РНК. Эти соотношения были сопоставлены с регуляцией EMA 0,33 мг дцДНК на 1 мг РНК. Из этого мы получили коэффициент увеличения в таблице 3 и на рисунке 1D.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
Для выделения плазмидной ДНК из клеток чашки диаметром 6 см с клетками плотности 80% трансфицировали половиной клинической дозы каждого флакона (150 мкл/лунку), добавленной к 1 мл среды. Нетрансфицированные клетки служили отрицательным контролем. После 6h клетки собирали, дважды промывали в PBS и очищали плазмидную ДНК (Gene Jet Plasmid Mini Kit). В каждую реакцию ПЦР загружали аликвоты 1-10 нг ДНК.
Для определения содержания ДНК во флаконах одну клиническую дозу каждого флакона разводили 1:10 в буфере EB (10 мМ Трис-HCl, pH 8,5) с добавлением 1% Тритона-X-100. Для реакции ПЦР праймеры были разработаны с использованием PrimerBlast и упорядочены с помощью Eurofins Genomics, растворены в воде, не содержащей нуклеаз, и использованы в конечной концентрации 0,2 мМ. Расположение пар праймеров по отношению к вектору экспрессии см. на рисунке 3А. 1 мкл разбавленного раствора использовали в качестве матрицы и обрабатывали в соответствии со стандартным протоколом Taq-полимеразы (94 °C 30 сек, 60 °C 30 сек, 72 °C, 30 сек, 38 циклов) с использованием ДНК-полимеразы Taq со стандартным буфером Taq (New England Biolabs #M0273S). Безнуклеазная вода служила отрицательным контролем. Флакон, содержащий партию GH9715, использовали в качестве положительного контроля, поскольку плазмидная ДНК из этой партии уже была выделена и секвенирована [21,22] и подтверждено, что она относится к плазмидной последовательности BNT162b2 (GenBank PP544445.1, GenBank PP544446.1, GenBank MQ287666.1, представляющей последовательность 16 из патент WO2021214204), опубликованный BioNTech. Нанесенные праймеры описаны в Таблице 1. Наконец, реакции ПЦР загружали в 2% агарозный гель с бромистым этидием в стандартном буфере ТАЕ (время работы ~ 1h; 100В). В качестве ДНК-маркера использовали смесь ДНК-лесенки Gene Ruler (Thermo Scientific #SM0331).
Таблица 1.
Характеристика праймеров, используемых для ПЦР.
Изоляция EV и концентрация секретома
Клетки выращивали в чашках диаметром 6 см до плотности 80% и трансфицировали половиной клинической дозы (150 мкл) двухвалентной партии GH9750, добавленной к 1 мл среды. Нетрансфицированные клетки служили отрицательным контролем. После 6ч клетки промывали и среду меняли на 5 мл свежей среды. После дальнейшего 18h среды собирали и клетки дважды промывали в PBS, собирали и далее обрабатывали для масс-спектрометрии.
Выделение EV проводили, как сообщалось ранее, с использованием метода захвата пептида Vn-96, который осаждает EV посредством связывания с HSP на поверхности EV [28,29]. Короче говоря, 20 мкл пептида VN-96 (набор для обогащения микровезикул, пептид Новой Англии, #W1073-2, США) добавляли к кондиционированной клетками среде (2 мл), полученной из клеток, трансфицированных HEK293 (не), и инкубировали на вращающемся колесе в течение 1 часа при комнатной температуре. EV выделяли после центрифугирования в течение 15 минут при 16000 xg при 4 °C. Супернатант (растворимый секретом) собирали в новую пробирку и концентрировали с помощью фильтра MWCO 3кДа (Merck, Амстердам, Нидерланды, кат. нет. UFC500396). Осадок EV промывали один раз 1 мл PBS (4 °C), содержащего PIC (полный Mini без ЭДТА, #11836153001 Roche, Германия).
Подготовка проб для протеомики
Подготовку проб для протеомики проводили, как описано ранее [30,31]. С этой целью аликвоту суспензии клеточных осадков в PBS, соответствующую ~25 мг белка, лизировали в 30 мл буфера для образцов СПД (содержащего 10% дитиотреитола, Life Technologies, Карлсбад, Калифорния, кат. нет. NP0008), 20 мл растворимого секретома лизировали 10 мл 3x буфера для образцов СПД и осадок EV растворяли в 30 мкл 1x буфера для образцов СПД, все при комнатной температуре. Затем образцы нагревали в течение 5 мин при температуре 99°СoС и обрабатывают ультразвуком (3х 20 сек) и фракционируют с помощью гель-электрофореза в сборных гелях Bis-Tris с градиентом 4-12% с использованием системы NuPAGE SDS-PAGE (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния) при комнатной температуре. После электрофореза гели фиксировали в растворе 50% этанола/3% фосфорной кислоты (Merck, Швейцария) и окрашивали в течение ночи смесью Coomassie Brilliant Blue R-250 (Thermo Scientific, Великобритания) при комнатной температуре. Затем гели промывали 25 мл 50 мМ бикарбоната аммония (Fluka, Зельце, Германия) и 25 мл 50 мМ бикарбоната аммония 50% ацетонитрилом (Biosolve BV, Валкенсваард, Нидерланды). Белки восстанавливали и алкилировали путем инкубации всего геля в 25 мл дитиотреитола в течение 1 часа при 56 °C и 25 мл 55 мМ йодацетамида (Sigma-Aldrich, США) в течение 45 минут при комнатной температуре соответственно. Гелевые дорожки разрезали на 3 полосы и каждую полосу разрезали на ~1 мм3 кубики. Кубики гелия из каждого полосели в центробежном испарителе SpeedVac в течене 10 миллионов при семперературе 50°С oC и ignkubirovali ~100-200 ml (docstatochno dlya pokrytiya) с modificirovánnynom thripsinom 6,25 ng/ml ddlia seckveninirovaniya (Promega, Madyson, США) в эти ночлег и при этой технологии. Пептиды из каждои полегцы гелия экстрагировали 100-150 мл 1% миравиной кислоты и два раза 100-150 мл 5% миравиной кислоты/50% алифизовали и кранили при -20 °C донализа ЖХ-МС/МС.
Протеомика на основе масс-спектрометрии
Безметочную протеомику образцов лизатов, EV и растворимого секретома проводили с использованием хроматографической системы Evosep, соединенной с системой TimsTOF-HT MS/MS (Брукер, Германия). Пептиды (600 нг/образец, как определено Nanodrop) растворяли в 0,1% FA и загружали в Evotips (Evosep, Дания) в соответствии с протоколом производителя. Пептиды разделяли с помощью нанопоточной обращенно-фазовой жидкостной хроматографии с использованием стандартизированных градиентов в системе жидкостной хроматографии Evosep One (Evosep, Дания) с 0,1% FA и 0,1% FA/99,9% ACN в качестве подвижных фаз при комнатной температуре. Метод 30 образцов в день (SPD) использовали в сочетании с колонкой с обращенной фазой размером 15 см x 150 мкм, заполненной 1,5 мкм C18-гранулами (Bruker Daltonics), соединенными с излучателем из плавленого кремнезема с плотностью 20 мкм ID (Bruker Daltonics). Пептиды вводили в TimsTOF HT (Bruker Daltonics) с использованием источника ионов наноэлектрораспыления (Captive spray source, Bruker Daltonics) с напряжением распыления, установленным на 1500 В. TimsTOF HT работал в режиме DDA-PASEF со временем линейного изменения, установленным на 100 мс, и за цикл сбора данных topN было получено десять сканирований PASEF, в результате чего время цикла составило 1,16 с. Предшественники с диапазоном масс от 100 м/з до 1700 м/з, подвижность ионов составляет от 1,5 до 0,7 Вс см−2, и проанализированы состояния заряда от 0 (неназначенные) до 5+. Порог интенсивности был установлен на уровне 2500 произвольных единиц (а.е.), а целевое значение - на уровне 20 000 а.е. Прекурсоры, достигшие этого целевого значения или полной мощности планирования, были исключены на 0,4 мин. Однозаряженные предшественники отфильтровывали в зависимости от положения их подвижности м/z-ионов. Выделяли прекурсоры массой менее 700 Да с квадрупольной шириной выделения 2 Th, прекурсоры выше 700 Да шириной 3 Th. Энергия столкновения линейно снижалась с 59 эВ при 1,6 В см-2 до 20 эВ при 0,6 Вс см-2. . . Для всех экспериментов размёр предвиденных ионов калибровалли линейно с использованием трёх выбраных изонов Agilent ESI LC/MS Tuning Mix [m/z, 1/K0: (322 0481, 0,7318 Vsm−2), (622 0289, 0,9848 против−2), (922 0097, 1 1895 против, см−2)].
Спектры МС/МС искали с использованием MaxQuant 2.3.1.0 по рассмотренному протеому человека (Uniprot, март 2023 г., 42420 записей, включая изоформы) и последовательностям вектора экспрессии мРНК Moderna1273, двухвалентного вектора экспрессии Pfizer BNT162b2 и тяжелого острого респираторного синдрома. Последовательность белка-шипа Ухань-Ху-1 изолирует коронавирус 2, а также продукты их трансляции со сдвигом рамки рибосомы. Ферментная специфичность была установлена на трипсин, и допускалось до двух пропущенных расщеплений. Карбамидометилирование цистеина (Cys, +57.021464 Да) рассматривали как фиксированную модификацию, а окисление метионина (Met, +15.994915 Да) и N-концевое ацетилирование (N-концевое, +42.010565 Да) - как вариабельные модификации. Идентификацию пептидов и белков фильтровали при FDR 1% с использованием стратегии базы данных ложных целей. Минимальная длина пептида составляла 7 аминокислот. Белки, которые невозможно было дифференцировать только на основе спектров МС/МС, были сгруппированы в группы белков (настройки MaxQuant по умолчанию). Поиски выполнялись с выбранным вариантом количественного определения без меток. Белки определяли количественно спектральным подсчетом [32].
Результаты
Успешная трансфекция клеток приводит к выработке белка-шипа
Липидные наночастицы, содержащие модРНК, представляют собой мощный инструмент для трансфекции клеток млекопитающих [33]. Чтобы проверить эффективность трансфекции, мы проанализировали характер экспрессии белков-шипов после трансфекции клеток эмбриональной почки человека (HEK293) четырьмя различными партиями вакцин BioNTech (Comirnaty), а именно моновалентными партиями FD7958, FE6975, EX8679 и бивалентной партией HD9869. Все четыре партии успешно трансфицировали клетки HEK293, о чем свидетельствует сильный иммуногистохимический сигнал белка-шипа (рис. 1А). Эффективность трансфекции по оценкам спайк-положительных клеток составила 90,5%, 74,6%, 76,4%, 80,7% и 0% для партий FD7958, FE6975, EX8679, HD9869 и необработанных клеток соответственно. Кроме того, трансфицированные клетки показали явные признаки цитопатического эффекта по сравнению с нетрансфицированной (контрольной) клеточной линией, о чем свидетельствует образование крупных вакуолей и отслоенных клеток (рис. 1В). Чтобы количественно оценить стабильность экспрессии белка-шипа с течением времени, мы измерили количество белка-шипа в клеточных лизатах через 1, 3, 5 и 7 дней, используя коммерчески доступный ELISA. Все четыре партии следовали одному и тому же шаблону экспрессии с уже четкой экспрессией белка-шипа после 1-го дня, увеличивая выработку до 5-го дня и еще более высокую концентрацию шипа на 7-й день, чем на 1-й день (рис. 1C).
Рисунок 1.
Экспрессия белка-шипа в клетках HEK293 после трансфекции биологическими препаратами BNT162b2. Ответ: Окрашивание белков-шипов в клетках, трансфицированных различными партиями, визуализируемыми зеленым цветом с помощью иммуногистохимии. Нетрансфицированные клетки (контроль) не окрашиваются. Гематоксилин служит противоокрашиванием ядер. Б: Микроскопия Брайтфилда трансфицированных клеток HEK293 различными партиями показывает накопление внутриклеточного образования везикул. C: Количественная оценка концентраций внутриклеточного шипового белка (SP) с течением времени, измеренная с помощью ELISA. n=2; среднее+СЕМ. D: Количественная оценка уровней секретируемого шипового белка (SP) с течением времени, измеренная с помощью ELISA. Для партии HD9869 концентрация секретируемого белка-шипа была ниже предела обнаружения. n=2; среднее+SEM. Отрицательный контроль не выявил содержания белка-шипа в клеточном лизате и клеточном супернатанте. SEM, стандартная ошибка среднего значения.
Белок Spike высвобождается в супернатант трансфицированных клеток
Чтобы определить, присутствуют ли белки-шипы только на клетках или могут ли они выделяться или секретироваться из трансфицированных клеток, мы проанализировали бесклеточный культуральный супернатант на наличие белков-шипов, применив ELISA. Измеренные значения представляют собой совокупные величины от дня 0 до соответствующего указанного момента времени. Мы наблюдали явное увеличение количества белка-шипа в среде с течением времени в трех одновалентных партиях. Концентрация белка-шипа в среде клеток, трансфицированных двухвалентной партией HD9869, была ниже предела обнаружения ELISA (рис. 1D).
Белок шипов в основном высвобождается через внеклеточные везикулы
Люминальная часть мембранных белков может расщепляться на поверхности мембраны различными клеточными секретазами и высвобождаться в среду, но нерасщепленные белки также могут секретироваться из клеток через внеклеточные везикулы (экзосомы). Мы использовали масс-спектрометрию, чтобы выяснить, по какому механизму шиповые белки секретируются в супернатант после искусственной трансфекции клеточной линии с помощью партии GH9715 в качестве модельной системы. С этой целью и трансфицированные клетки, и среду собирали после 24 часов трансфекции. В результате выделения внеклеточных везикул (ВВ) из среды мы получили три фракции – клеточного лизата, ЭВ и среду, не содержащую ЭВ, для профилирования протеомов. Результаты содержания белка-шипа в трех фракциях представлены в таблице 2. Спайковый белок был наиболее распространен в лизате (60 спектральных подсчетов) и явно присутствовал в ЭВ (14 спектральных подсчетов), тогда как в среде, свободной от ЭВ, были обнаружены только низкие уровни (2 спектральных подсчета). Важно отметить, что контрольные трансфицированные клетки были отрицательными по белку-шипу, и, как и ожидалось, общие маркеры EV (CD81, TSG101, Alix) были обогащены фракцией EV по сравнению с растворимым секретомом и обнаружены как в трансфицированных, так и в нетрансфицированных клетках.
Таблица 2.
Количество спектральных подсчетов (содержание белка) в определенных фракциях клеточной линии HEK293, трансфицированных двухвалентным флаконом BioNTech GH9715.
Концентрация РНК тестируемых флаконов соответствует декларации BioNTech
Чтобы подтвердить качество партий, используемых в реакциях трансфекции, мы проверили содержание РНК во флаконах с помощью анализа высокой чувствительности РНК Qubit. Результаты подтвердили, что флаконы содержали количество РНК, заявленное производителем, равное 30 мкг РНК на клиническую дозу (рис. 2А). При проведении трехкратного анализа содержание РНК в партии FD7958 составило 26,74 + 0,31 (среднее значение + SEM) мкг РНК на расчетную клиническую дозу, партия FE6975 содержала 28,57 + 0,22 мкг РНК, партия EX8679 26,51 + 0,59 мкг РНК и партия HD9869 28,12 + 0,47 мкг РНК на клиническую дозу, что демонстрирует высокую надежность метода обработки и количественного определения нуклеиновых кислот, используемого здесь.
Большие количества ДНК обнаруживаются в партиях протестированных РНК-вакцин
Благодаря сообщениям об остаточной ДНК партий BNT162b2 [27] все четыре партии, использованные здесь, были проанализированы с помощью трех различных методов на предмет возможной остаточной ДНК, которая может возникнуть в результате производственного процесса с использованием плазмид ДНК и систем экспрессии E. coli. Три системы количественного определения ДНК Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay (P), Qubit 1x dsDNA High Sensitivity Assay (Q) и AccuBlue dsDNA High Sensitivity Assay (A) были применены непосредственно к исходным вакцинным растворам. Результаты обобщены на рисунке 2B.
В предварительном тесте мы применили 1% Тритон-Х-100, чтобы открыть ЛНП и количественно оценить все количество дцДНК (свободной и упакованной в ЛНП), присутствующее во флаконах. Как показано в Таблице 3, содержание дцДНК в исходных необработанных образцах было явно ниже (фактор 1,6-6,7 в зависимости от партии) по сравнению с аликаутами, обработанными Triton-X-100. Все следующие эксперименты были проведены с обработкой Triton-X-100.
Table 3.
Уровни ДНК в указанных флаконах партий BioNTech до обработки РНКазой А, без и при обработке Тритоном-Х-100. Фактор представляет собой увеличение ДНК при высвобождении нуклеиновых кислот из LNP, расщепленной Тритоном. SEM, стандартная ошибка среднего значения.
Прямой анализ содержимого флаконов, разведенных в соотношении 1:10 забуференным физиологическим раствором, не содержащим РНКазы, с 1% Triton-X-100, выявил высокие концентрации двухцепочечной (ds) ДНК между 1326 – 4225 нг на клиническую дозу, при этом AccuBlue метод показывает самые низкие концентрации ДНК в трех партиях и ту же концентрацию, что и метод Кубита в партии FE6975. Для трех из четырех протестированных партий (FE6976, EX8679 и HD9869) анализ Пико Грина показал самую высокую концентрацию ДНК, тогда как для партии FD7958 анализ Кубита показал немного более высокую концентрацию ДНК, чем анализ Пико Грина. Внутренние различия внутри партии и метода измерения были минимальными, что исключало любые ошибки обработки и подтверждало надежность результатов. Это сравнение трех различных систем анализа показало частично схожие, частично большие различия в концентрации ДНК в соответствующих партиях, что указывает на важный аспект при сравнении результатов между различными методами анализа.
Чтобы исключить возможность того, что используемые наборы, вопреки их утверждению о том, что они являются дцДНК-специфичными, действительно частично обнаруживают РНК в присутствии высоких количеств РНК, те же образцы, которые были ранее измерены на Фигуре 2В, впоследствии были обработаны РНКазой А (Таблица 4). В течение 3 минут показания ДНК резко упали и оставались стабильными в течение оставшихся 30 минут инкубации, что позволяет предположить, что a) интеркалирующие красители действительно реагируют с РНК и b) обработка РНКазой в достаточной степени удалила всю интерферирующую РНК, при этом в образцах не осталось РНК. в конце лечения. Опять же, внутри тройных показателей, анализируемых независимо, наблюдались лишь минимальные различия. Интересно отметить, что измерения с помощью AccuBlue из необработанных образцов показали самый низкий уровень ДНК, а при обработке РНКазой-А - самое высокое содержание, отражающее самое низкое взаимодействие с РНК из трех использованных тест-систем. Похоже, что AccuBlue демонстрирует наименьшее перекрестное взаимодействие с РНК при измерении концентрации ДНК, что соответствует наблюдению, описанному другими [34]. Из этих данных можно предположить, что значения ДНК, полученные после обработки РНКазой-А, представляют собой реальную концентрацию ДНК во флаконах без интерферирующей РНК. Эта теперь “pure” остаточная ДНК отдельных флаконов составляла от 32,71 нг до 43,38 нг на клиническую дозу (рис. 2C). Это соответствует 1,23 мкг – 1,62 мкг дцДНК на мг РНК и, таким образом, превышает верхний предел ДНК Европейского медицинского агентства (EMA) в 4-5 раз (таблица 2; рисунок 2D).
Рисунок 2.
Содержание РНК и ДНК различных биологических препаратов BNT162b2. О: Уровни модРНК на клиническую дозу определяли во флаконах с помощью Qubit. n=3, среднее±SEM. BC: Уровни двухцепочечной (ds) ДНК на клиническую дозу в различных флаконах, измеренные с помощью Picco Green (P), Qubit (Q) и AccuBlue (A) без РНКазы А (рис. B) и лечения РНКазой А (C). Пунктирная линия показывает предел EMA разрешенных уровней дцДНК в биологических препаратах. n=3, mean±SEM. D: Соотношение между содержанием дцДНК и РНК во флаконах и предел, который был превышен в соответствии с регуляцией EMA 0,33 мг дцДНК на 1 мг РНК (пунктирная линия). SEM, стандартная ошибка среднего значения.
Таблица 4.
CRNA and DNA levels (following Triton-X-100 treatment) in the indicated vials of BioNTech lots before and after RNase A treatment. Factor represents the multiplier for exceeding the limit value in accordance with the EMA regulation of 0.33ug dsDNA per 1mg RNA. SEM, standard error of the mean.
Residual DNA Contains Process-Related Plasmid Elements And Is Taken Up By The Cells
Чтобы определить, происходит ли ДНК, обнаруженная во флаконах, из плазмиды-ДНК, используемой в процессе производства мРНК, были созданы пары праймеров против последовательностей различных генов (промотор/энхансер SV40, кассета неомицина, репликон ORI и белок-шип), представляющих всю карту плазмиды (рис. 3А). Флакон, содержащий партию GH9715, использовали в качестве положительного контроля, поскольку плазмидная ДНК из этой партии уже была выделена и секвенирована [21,22] и подтверждено, что она относится к плазмидной последовательности BNT162b2 (GenBank PP544445.1, GenBank PP544446.1, GenBank MQ287666.1, представляющей последовательность 16 из патента WO2021214204), опубликованного BioNTech. МакКернану удалось доказать, что идентифицированная ДНК действительно является плазмидной ДНК, необходимой для процесса производства мРНК. Положительный контроль показал фрагмент ДНК правильного размера для всех пар праймеров (рис. 3B). Отрицательный контроль (вода) вообще не выявил сигнала. Интересно, что все четыре флакона, протестированные в разведении 1:10, показали сильные сигналы для всех фрагментов ДНК разных генов.
Чтобы выяснить, были ли клетки HEK293 в нашей системе не только трансфицированы вакцинной РНК (что приводит к доказанной экспрессии спайка), но и в дополнение к остаточной плазмидной ДНК, ДНК выделяли и очищали из тщательно промытых и выделенных трансфицированных клеток. Как показано на рисунке 3B, нам удалось обнаружить все продукты ПЦР правильного размера, представляющие исследуемые плазмидные гены в клетках после трансфекции всеми четырьмя партиями. В соответствии с двумя копиями промотора/энхансерного элемента SV40 размером 72 п.н., соединенными кассетным образом в плазмиде (основания региона 1041 – 1185 GenBank PP54446; рисунок 3C), ПЦР промотора/энхансера SV40 привела к образованию двух ампликонов ожидаемых размеров (рис. 3D). Эти положительные сигналы были возможны даже при наличии только 1-10% количества ДНК, обычно используемой в реакции ПЦР (рис. 3B).
Рисунки 3A и 3B.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) выявляет остаточную ДНК всей плазмиды, используемой в процессе производства модРНК. Ответ: Схематическое изображение плазмиды ДНК, используемой BioNTech в качестве матрицы для производства модРНК. Специфические последовательности (промотор/энхансер SV40; кассета, устойчивая к неомицину, репликон ORI, белок-шип) выделены цветом, как и последовательности, используемые для обнаружения этих генов, которые пронумерованы от 1 до 7. Б: Визуализированные фрагменты ДНК после ПЦР указанных последовательностей (рис. А, 1-7) показывают обнаружение всех генов ДНК-плазмиды во флаконах (справа, разбавленных 1:10 перед загрузкой в ПЦР) и в плазмидных препаратах из клетки, трансфицированные этими биологическими препаратами (слева). Мок означает нетрансфицированные клетки как отрицательный контроль для левой части и воду как отрицательный контроль для правой части. Лот GH9715 служил положительным контролем.
Рисунки 3C и 3D.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) выявляет остаточную ДНК элемента SV40 размером 72 п.н. в модРНК. C: Карта области промотора/энхансера SV40 показывает две копии элемента размером 72 п.н., в результате чего два ампликона становятся видимыми в ПЦР благодаря двум сайтам связывания обратного праймера в сочетании с единственным сайтом связывания прямого праймера. D: Дополнительная ПЦР для промотора/энхансера SV40 (те же условия ПЦР, что и на рисунке 3B, за исключением более длительного времени), чтобы лучше разделить и визуализировать два ампликона при 165 п.н. и 93 п.н.
Обсуждение
Мы проанализировали содержание нуклеиновых кислот в четырех флаконах BNT162b2 (Comirnaty), распространенных в Германии, и обнаружили, что концентрация РНК соответствует спецификации производителя в 30 мкг на клиническую дозу, демонстрируя точность нашего анализа. Кроме того, мы идентифицировали остаточную ДНК, включая плазмидную ДНК, в количествах, аналогичных тем, о которых сообщили McKernan et al. [21,22] для партий US-Pfizer. Концентрации ДНК во флаконах, проанализированных в этом исследовании, колебались от 32,7 до 43,4 нг на клиническую дозу после удаления РНК посредством расщепления РНКазой. Это намного превышает максимальный верхний предел в 10 нг на клиническую дозу, который ВОЗ объявила переносимым для инъекционных биологических препаратов [35].
Чтобы можно было проанализировать общее содержание ДНК, присутствующее во флаконах, мы провели обработку Triton-X-100 для открытия ЛНП. Сравнение необработанных растворов вакцин с обработанными Triton-X-100 парными аликвотами показало увеличение содержания ДНК в 1,6-6,7 раза, что, вероятно, отражает высокую вариабельность упаковки LNP остатков ДНК в процессе производства. Наши результаты соответствуют данным Рауля [36], который недавно сообщил об явном увеличении содержания ДНК после открытия ЛНП в одной партии Комирнати. Количество остаточной ДНК, высвободившейся из ЛНП при обработке Тритоном-Х-100, проанализированное в этом исследовании, меньше, чем сообщалось недавно [27]. Мы подозреваем, что это может быть связано с перекрестным взаимодействием РНК с интеркалирующими красителями [37]. Действительно, когда образцы обрабатывали РНКазой, концентрации ДНК заметно снижались, хотя и до уровней, которые все еще оставались во много раз выше пределов, которые считались приемлемыми для голой ДНК. В недавнем препринте [38] сообщалось, что связанные с продуктом примеси ДНК в BNT162b2 совпадают с утвержденными спецификациями мРНК. Однако авторы провели дополнительный этап осаждения этанолом перед анализом Кубита, который, как известно, неэффективно осаждает короткие последовательности ДНК, представляющие большую часть напоминающей ДНК, после расщепления ДНКазой во время производственного процесса. Этот подход привел к высокой внутрипериодической вариабельности рассчитанного количества РНК в двух партиях Комирнати. Хотя наши результаты (полученные без осаждения этанолом) показали лишь низкое рассеяние между партиями и содержание РНК, почти идентичное и близкое к содержанию 30 мкг, указанному на дозу, расчетное содержание РНК Kaiser et al. [38] был намного ниже, максимум 20 мкг на дозу. Это говорит о том, что они, вероятно, потеряли значительное количество нуклеиновых кислот во время подготовки образца. Как и в случае с низкой результирующей концентрацией РНК, их анализ ДНК также привел к слишком низким концентрациям и не отражает реальное содержание остаточной ДНК по сравнению с начальной концентрацией ДНК во флаконах (свободных и упакованных в LNP) до осаждения, потери на стадиях промывки и разрешения.
Следует отметить, что официальные предельные значения остаточной ДНК в биологических препаратах определены для антител, аттенуированных вакцин и белковых растворов, но не для инъекций РНК и –, что еще более важно, – для нуклеиновых кислот, упакованных в реагенты для трансфекции, такие как липидные наночастицы, которые использовались для впервые в инъекциях COVID-19 [39]. Фактически, не существует никаких научных доказательств, которые позволили бы определить уровень безопасности остаточной ДНК в таких инъекциях.
Еще более тревожной является идентификация последовательностей генов, которые раскрывают остатки партий BNT162b2, с плазмидной ДНК, которая использовалась в качестве системы экспрессии в производственном процессе [9]. Первоначально присутствие интактных плазмид было продемонстрировано МакКернаном и его коллегами [21,22] в экспериментах по трансформации, в ходе которых кодируемая плазмидой устойчивость к канамицину была придана реципиенту E. coli. Однако дополнительный вопрос о том, может ли также произойти трансфекция человеческих клеток, еще не решен. После трансфекции клеточных культур без каких-либо дополнительных реагентов для трансфекции последовательности плазмидного происхождения, такие как ген канамицина и промотор/энхансер SV40, впоследствии могут быть повторно изолированы от трансфицированных клеток, что позволяет предположить, что упаковка в липидные наночастицы и трансфекция в клетки происходили, поскольку свободные, неупакованная ДНК не будет поглощена клетками. Таким образом, за поглощением клеток не следует быстрая деградация и утилизация плазмидной ДНК. Хотя дальнейшие исследования должны выяснить, может ли остаточная плазмидная ДНК также служить матрицей для генерации функциональных белков в клетке, наши результаты не оставляют места для сомнений в том, что остаточная плазмидная ДНК и ее производные фрагменты, содержащиеся в РНК, биологические вещества попадут во множество клеток у реципиентов-людей. Однако мы не смогли продемонстрировать, содержат ли некоторые из трансфицированных клеток интактные плазмиды, присутствие идентифицированной области промотора/энхансера SV40 вызывает большую тревогу независимо от присутствия плазмиды [23,40,41].
Наш молекулярный анализ компонентов плазмиды подтвердил данные, предоставленные МакКернаном и его коллегами [21,22], а именно наличие последовательности ДНК промотора/энхансера SV40. Эта последовательность не была заявлена на карте плазмид, представленной BioNTech/Pfizer в процедуре утверждения [42, стр. 24]. Это открытие очень удивительно и поднимает законный вопрос: почему BioNTech/Pfizer применили этот совершенно ненужный, но очень опасный элемент в своих плазмидах и использовали его в качестве матрицы для производства модРНК? По нашему мнению, BioNTech/Pfizer должны нести ответственность за включение этого крайне опасного элемента в свои плазмиды.
По своей конструкции плазмиды, используемые BioNTech и Pfizer, представляют собой так называемые челночные векторы. Они содержат сайты клонирования и сигналы полиаденилирования, а также элементы, необходимые для репликации и трансляции в бактериальных системах, такие как фаговый промотор Т7, и, кроме того, промотор/энхансерный элемент, позволяющий инициировать транскрипцию в эукариотических клетках, которые обычно происходят из вирусов, таких как CMV или SV40. Один из первых челночных векторов, послуживших своего рода прототипом нынешней плазмиды BioNTech/Pfizer, был создан еще в 1988 году [43]. Аналогичный компонент SV40, содержащий векторы экспрессии млекопитающих [Addgene: pcDNA3.1 SARS-CoV-2 S D614, однако без бактериальных компонентов], использовался уже в 2020 году для анализа функций белка-шипа в клеточных линиях человека [44].
Согласно официальному процессу генерации РНК, кодирующей белок-шип, не требуется эукариотический промотор/энхансер, поскольку выполняется весь процесс-2 ин-витро в бактериальной Кишечная палочка система. Кроме того, среди доступных сильных вирусных промоторных/энхансерных элементов, таких как ЦМВ, бакуловирус и RSV, элемент SV40 является наиболее опасным для целостности клеток-мишеней, поскольку задолго до разработки биологических препаратов РНК было показано, что 72 п.н. Фрагмент промотора/энхансера SV40 облегчает максимальный транспорт плазмидной ДНК в ядро трансфицированных клеток [23,41], функция, отсутствующая в элементах CMV и RSV. Очевидно, что один аспект должен вызвать тревогу, выраженную Дином и др. [23]: “Включение этой последовательности SV40 в невирусные векторы может значительно увеличить их способность транспортироваться в ядро, особенно в неделящихся клетках.” Этот транспорт плазмид, содержащих промотор/энхансерный элемент SV40, в ядро был обнаружен для широкого спектра протестированных типов клеток [45], что привело к продвижению промотора/энхансерного элемента SV40 для высокоэффективных подходов генной терапии. Обнаружение этих последовательностей промотора/энхансера SV40 ставит вопрос, какое намерение имели производители при выборе системы экспрессии, содержащей этот активный элемент клеток млекопитающих, вместо выбора чистой прокариотической системы экспрессии для производственного процесса.
Наконец, мы демонстрируем, что трансфицированные клетки способны продуцировать и секретировать шиповые белки. Мы не использовали никаких других веществ, усиливающих трансфекцию, ни при одной из трансфекций. Это позволило нам проанализировать прямой перенос гена чистого вещества из липидных наночастиц в качестве реагента для трансфекции “в клетки-хозяева, имитирующие ситуацию у вакцинированных лиц. Известно, что дополнительное введение усилителей трансфекции, таких как аполипопротеин Е3 (ApoE3), который связывается с холестерином липидной оболочки ЛНП и, таким образом, облегчает поглощение ЛНП клетками через рецепторы ApoE3, привело бы к более высокая эффективность трансфекции. Эффективность трансфекции также можно повысить за счет изменения линии клеток-мишеней или увеличения введения ЛНП. Таким образом, наши измеренные значения внутриклеточных и внеклеточных спайковых концентраций относятся только к клеткам HEK293 при указанных параметрах, которые подробно описаны в разделе "Методы". После трансфекции в наших клетках наблюдались большие внутриклеточные везикулы, что представляет собой явную особенность нарушения здоровья клеток после поглощения модРНК, содержащей LNP. Оболочка последнего состоит из четырех липидных компонентов. В частности, группа катионных (ионизируемых) липидов хорошо известна своим токсическим и провоспалительным действием на клетки как in vitro, так и in vivo [46]. В настоящее время неизвестно, сколько и какие типы клеток в организме поражены, но сообщалось, что ЛНП распространяется по организму, а модРНК обнаруживается во всех исследованных органах [9]. Мы заметили, что производство белков-шипов длится много дней. Через неделю в клетках присутствует еще больше белков-шипов, чем через 24 часа, хотя самый высокий уровень модРНК ожидается через 24 часа, прежде чем она разложится. Количество продуцируемых белков-шипов варьировалось в зависимости от партии, но прогрессирование с течением времени было одинаковым для всех, с пиком на 5-й день после трансфекции. Мы также показали, что уровень продукции связан с количеством введенной модРНК, поскольку партия HD9869 показывает значительно более низкий уровень белка-шипа, чем три другие партии. Это произошло из-за того, что HD9869 представляет собой двухвалентную вакцину, состоящую из двух разных модРНК для двух разных вариантов шипового белка, а именно варианта Ухани и варианта Омикрона. Поскольку ELISA, примененный в этом исследовании, обнаруживает только вариант Ухани, белки-шипы, продуцируемые вариантом Омикрона, не обнаруживаются, и мы получаем более низкие значения, чем для трех моновалентных вакцин, содержащих только вариант Ухани.
Используя масс-спектрометрию, мы смогли продемонстрировать, что белки-шипы почти исключительно высвобождаются в среду через экзосомы. В случае ситуации in vivo это будет означать, что белки-шипы транспортируются внутри экзосом в другие ткани и органы через кровоток и, следовательно, поглощаются клетками-мишенями. Фактически, уже сообщалось, что белки-шипы можно найти в экзосомах вакцинированных лиц [10]. Функции экзосом многообразны. В основном они служат коммуникационной платформой между клетками одной ткани и между клетками разных органов. Экзосомы легко поглощаются клетками-мишенями посредством различных механизмов, и таким образом их содержимое попадает в клетку-мишень и вызывает структурный и функциональный ответ [47]. В случае BNT162b2 можно предположить, что белки-шипы могут переноситься и захватываться из одной ткани в другую таким образом независимо от присутствия LNP или модРНК. Повреждены ли клетки-мишени поглощением экзосом, содержащих шиповый белок, еще не исследовано. Однако эта мощная способность к трансфекции вызывает будильники в свете фона котрансфицированной остаточной ДНК и особенно элементов промотора/энхансера SV40 первичного материала, плазмиды. В предварительных экспериментах еще одна партия BNT162b2 была способна трансфицировать клетки рака яичников, и здесь в результате полногеномного секвенирования действительно было обнаружено, что части трансфицированного материала нуклеиновой кислоты интегрированы в хромосомы 9 и 12 клеток [48].
Последовательность модРНК показывает, что лидерная последовательность трансляции белка-шипа в просвет эндоплазматического ретикулума и последовательность мембранного якоря не были удалены из модРНК. Как следствие, продуцируемые белки-шипы преимущественно экспрессируются на поверхности клеток. По данным BioNTech, модРНК транслируется в цитозоле [49]. Это будет означать, что белки-шипы остаются внутри клеток и не представлены в виде полноразмерных белков на поверхности клеток. Однако это противоречит функции лидера и якорной последовательности внутри РНК в других мембранных белках. Возможность выделения белков-шипов также не рассматривалась BioNTech [49].
Ограничение исследования и изменчивость данных
Мы использовали технические и биологические повторы (где это уместно), чтобы воспроизвести наши результаты и определить изменчивость. Поскольку изменчивость каждого эксперимента внутри группы была небольшой, мы можем исключить технические артефакты. У нас был доступ лишь к нескольким лотам, но мы сочли их достаточными, чтобы продемонстрировать фундаментальную проблему остаточной ДНК и трансфекции клеток “РНК-вакцинами.” Когда проводились эксперименты (2023 г.), срок годности трех партий моновалентной вакцины, указанных производителем, уже прошел. В связи с тем, что флаконы постоянно хранились невскрытыми при -80 °C и что срок годности официально несколько раз продлевался немецким Институтом Пауля Эрлиха (PEI) [50: 10. Сентябрь 2021 г. с 6 по 9 месяцев; 51: 24. Март /4. Апрель 2022 г. с 9 до 12 месяцев; 52: 2. Декабрь 2022 г., от 12 до 18 месяцев], мы не ожидаем каких-либо негативных последствий для наших результатов. Мы не можем исключить, что вакцины также содержат и трансфицируют стабильные двухцепочечные гибриды РНК (дцРНК) и РНК: ДНК параллельно одноцепочечной модРНК и векторной ДНК. Мы также не можем полностью составить карту токсичности ЛНП для различных типов клеток. Для наших экспериментов мы использовали относительно надежную линию клеток эмбриональной почки человека, которая иммортализована и поэтому может выдерживать токсичные вещества до определенного уровня. Необходимы дальнейшие исследования для тестирования, например, первичных клеточных культур, таких как первичные нейрональные клетки или иммунные клетки, которые будут гораздо более чувствительно реагировать на ЛНП. Поскольку известно, что ЛНП распределены по всему организму и, таким образом, вероятно, влияют на все типы клеток, необходимо провести дальнейшие исследования in vitro токсичности, экспрессионного поведения и анализа протеома.
Заключение
Мы продемонстрировали, что трансфекция линии клеток человека HEK293 четырьмя различными партиями BNT162b2 приводит к выработке белков-шипов в течение нескольких дней, которые высвобождаются в клеточный супернатант через экзосомы. Мы обнаружили остаточную плазмиду-ДНК во всех флаконах в концентрациях, намного превышающих допустимый предел ЭМА в 0,33 нг дцДНК на 1 мг РНК. Мы идентифицировали все плазмидные гены, а также две копии промотора/энхансера SV40 размером 72 п.н. Было показано, что ДНК проникает и сохраняется в клетках.
Еще до начала правительственной кампании вакцинации врачи и ученые отмечали, что агенты на основе генов могут спровоцировать серьезные нежелательные явления. Тем временем спектр нежелательных побочных явлений стал настолько многогранным, что для обозначения нового комплекса заболеваний был создан термин “spikeopathy” [53]. Вечные опасности всех РНК-биологических препаратов 4-кратны: Во-первых, модРНК, кодирующая любой чужеродный белок, вызовет пагубные аутоиммунные реакции [54]. Во-вторых, липидные наночастицы сами по себе очень токсичны [55]. В-третьих, остаточная плазмидная ДНК и мРНК с обратной транскрипцией будут генетически модифицировать клетки. В-четвертых, замена уридина в природной мРНК N1-метилпсевдоуридином в синтетической модРНК вызывает сдвиг рамки рибосом +1, что приводит к бессистемному производству совершенно чужеродных белков [56].
Наши результаты подтверждают и расширяют опубликованные отчеты и вызывают серьезную обеспокоенность по поводу безопасности вакцины BNT162b2. Мы призываем к немедленному прекращению использования всех биологических препаратов на основе РНК до тех пор, пока эти проблемы не будут научно решены и убедительно развеяны.
Благодарности
Мы благодарим Базовый центр протеомики Амстердамского UMC в Нидерландах за поддержку масс-спектрометрии и Маартена Форнерода за анализ данных масс-спектрометрии для определения содержания плазмиды и альтернативных пептидов ORF.
Авторские вклады: Концептуализация, Великобритания, В.С. и КС; методология, Великобритания и В.С.; программное обеспечение, В.С.; валидация, Великобритания и В.С.; формальный анализ, Великобритания, В.С. и К.С.; расследование, Великобритания и В.С.; ресурсы, Великобритания и В.С.; курирование данных, Великобритания и В.С.; написание —оригинальной подготовки проекта, Великобритания, В.С. и К.С.; написание —обзора и редактирование, Великобритания, В.С. и К.С.; визуализация, Великобритания и В.С.; надзор, Великобритания, В.С. и К.С.; администрирование проекта, В.С. и К.С.; администрирование проекта, В.С. и К.С.; Все авторы прочитали и согласились с опубликованной версией рукописи.
Финансирование: Это исследование не получило внешнего финансирования.
Конфликты интересов: Авторы не заявляют о конфликте интересов.
Ссылки
1
Винч, Г.М, Цао, Д, Майторена-Санчес, Э, Пинто, Дж, Сергеева, Н, Чжан, С. Операция Warp Speed: проекты реагирования на пандемию COVID-19. Руководство проектом и общество. 2:100019. 2021. https://doi.org/10.1016/j.plas.2021.100019
2
Операция Warp Speed. 2021. Доступно онлайн: https://www.gao.gov/products/gao-21-319 (по состоянию на 25.06.2024)
3
Тюречи, Ö., Шахин, У. Проект Lightspeed (нем.). 2021. ISBN10 3498002775.
4
Проект Lightspeed. 2020. Доступно онлайн: https://www.pei.de/SharedDocs/Downloads/EN/newsroom-en/dossiers/ppt-erste-studie-sars-cov-2-impfstoff-en.pdf?__blob=publicationFile&v=2 (по состоянию на 25.06.2024)
5
Франция24. 2020. Доступно онлайн: https://www.pfizer.com/science/innovation/mrna-technology (по состоянию на 25.06.2024)
6
Веб-страница БиоНТех. https://www.biontech.com/int/en/home/pipeline-and-products/platforms/our-mrna-platforms.html
7
Веб-страница Pfizer. https://www.pfizer.com/science/innovation/mrna-technology
8
Выстрел всей жизни. Доступно онлайн: https://www.pfizer.com/news/articles/shot_of_a_lifetime_how_pfizer_and_biontech_developed_and_manufactured_a_covid_19_vaccine_in_record_time (по состоянию на 24.06.2024)
9
Отчет об оценке EMA. 2021. Доступно онлайн: https://www.ema.europa.eu/en/documents/assessment-report/comirnaty-epar-public-assessment-report_en.pdf (по состоянию на 25.06.2024)
10
Бансал, С., Перинчери, С., Флеминг, Т., Поулсон, К., Тиффани, Б., Бремнер, Р.М., Моханакумар, Т. Край разреза: циркулирующие экзосомы с белком-шипом COVID индуцируются вакцинацией BNT162b2 (Pfizer-BioNTech) до разработки антител: новый механизм иммунной активации мРНК-вакцинами. Журнал иммунологии. 207:2405-2410. 2021. https://doi.org/10.4049/jimmunol.2100637
11
Мёрц, М. Отчет о случае: мультифокальный некротический энцефалит и миокардит после вакцинации мРНК BNT162b2 против COVID-19. Вакцины. 10:1651. 2022. https://doi.org/10.3390/vaccines10101651
12
Ханна, Н., Лин, Х., Томас, К., Винцилеос, А., Чавес, М., Палайя, Т., Раголия, Л., Верма, С., Хуллар, П., Ханна, И. Недооценка инфекции SARS-CoV-2 в образцах плаценты. Американский журнал акушерства и гинекологии. 225:572-575.e1. 2021. https://doi.org/10.1016/j.ajog.2021.07.010
13
Дхули, К., Медори, М.К., Микелетти, К., Донато, К., Фиоретти, Ф., Кальцони, А., Прадерио, А., Де Анджелис, М.Г., Арабия, Г., Кристони, С., Нодари, С., Бертелли, М. Наличие белка вирусного шипа и белка вакцинного шипа в сыворотке крови пациентов с синдромом длительного COVID. Европейский обзор медицинских и фармакологических наук. 27 (Дополнение. 6):13-19. 2023. https://doi.org/10.26355/eurrev_202312_34685
14
Sahin, U., Karikó, K., Türeci, Ö. mRNA-based therapeutics–developing a new class of drugs. Nature Reviews Drug Discovery. 13:759-780. 2014. https://doi.org/10.1038/nrd4278
15
Карико, К., Бакштейн, М., Ни, Х., Вайсман, Д. Подавление распознавания РНК Toll-подобными рецепторами: влияние модификации нуклеозидов и эволюционное происхождение РНК. Иммунитет. 23:165-175. 2005. https://doi.org/10.1016/j.immuni.2005.06.008
16
Гранадос-Риверон, Дж.Т, Акино-Жаркин, Г. Разработка современных модифицированных нуклеозидами вакцин мРНК-ЛНП против SARS-CoV-2. Биомедицина и фармакотерапия. 142. 2021. https://doi.org/10.1016/j.biopha.2021.111953
17
Чжан Л., Ричардс А., Барраса М.И., Йениш Р. Обратно транскрибируемая РНК SARS-CoV-2 может интегрироваться в геном культивируемых клеток человека и экспрессироваться в тканях, полученных от пациента. Труды Национальной академии наук. 118:e2105968118. 2021. https://doi.org/10.1073/pnas.2105968118
18
Олден, М., Олофссон Фалья, Ф., Ян, Д., Баргхут, М., Луан, К., Расмуссен, М., Де Маринис, Ю. Внутриклеточная обратная транскрипция мРНК-вакцины Pfizer BioNTech против COVID-19 BNT162b2 in vitro в клеточной линии печени человека. Текущие проблемы молекулярной биологии. 44:1115-1126. 2022. https://doi.org/10.3390/cimb44030073
19
Саттон, Д.Х., Конн, Г.Л., Браун, Т., Лейн, А.Н. Зависимость активности ДНКазы I от конформации олигодезоксинуклеотидов. Биохимический журнал. 321:481-486. 1997. https://doi.org/10.1042/bj3210481
20
Веб-страница Термофишер. https://www.thermofisher.com/de/de/home/references/ambion-tech-support/nuclease-enzymes/general-articles/dnase-i-demystified.html
21
МакКернан, К. Бивалентные вакцины Pfizer и Moderna содержат 20-35% вектора экспрессии и способны к трансформации E. coli. 2023. https://anandamide.substack.com/p/pfizer-and-moderna-bivalent-vaccines
22
МакКернан, К., Хелберт, Ю., Кейн, Л.Т., Маклафлин, С. Секвенирование двухвалентных мРНК-вакцин Moderna и Pfizer выявляет количества дцДНК вектора экспрессии от нанограмма до микрограмма на дозу. Препринты OSF. 2023. https://doi.org/10.31219/osf.io/b9t7m
23
Дин, Д.А, Дин, Б.С, Мюллер, С, Смит, Л.К. Требования к последовательностям при импорте плазмидной ядерной энергии. Экспериментальные клеточные исследования. 253713-22. 1999. https://doi.org/10.1006/excr.1999.4716
24
Секвенирование моновалентных мРНК-вакцин Pfizer также выявило двойной копия промотора SV40 размером 72 п.н. 2023. https://anandamide.substack.com/p/sequencing-the-pfizer-monovalent
25
25.Направленная на вакцину кПЦР линий раковых клеток, обработанных BNT162b2. 2024. https://anandamide.substack.com/p/vaccine-targeted-qpcr-of-cancer-cell
26
Спейчер, Д.Дж., Роуз, Дж., Гучи, Л.М., Уайзман, Д.М., МакКернан, К. Фрагменты ДНК, обнаруженные в моновалентных и двухвалентных вакцинах Pfizer/BioNTech и модРНК Moderna против COVID-19 из Онтарио, Канада: исследовательская взаимосвязь "доза-эффект" с серьезными нежелательными явлениями. Препринты OSF. 2023 https://doi.org/10.31219/osf.io/mjc97
27
Кёниг, Б., Киршнер, Дж.О. Методологические соображения относительно количественного определения примесей ДНК в мРНК-вакцине COVID-19 Comirnaty. Методы и протоколы. 7:41. 2024. https://doi.org/10.3390/mps7030041
28
Гош, А.А., Дэйви, М., Чют, И.К., Гриффитс, С.Г., Льюис, С., Чако, С., Барнетт, Д., Крапуле, Н., Фурнье, С., Джой, А., Кейсси, М.К., Фергюсон, А.Д., Дэйгл, М., Мели, М.В., Льюис, С.М., Уэллетт, Р.Дж. Быстрое выделение внеклеточных везикул из клеточной культуры и биологических жидкостей с использованием синтетического пептида со специфическим сродством к белкам теплового шока. ПЛос Один. е110443. 2014. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0110443
29
Кнол, Дж.К., де Ройс, И., Шелфхорст, Т., Бикхоф, Р., Де Вит, М., Пирсма, С.Р., Фам, Т.В., Смит, Э.Ф., Верхойл, Х.М.В., Хименес, CR Пептид-опосредованное выделение внеклеточных везикул ‘miniprep’ подходит для высокопроизводительной протеомики. Европейская ассоциация протеомики Открытая протеомика. 11:11–15. 2016 https://doi.org/10.1016/j.euprot.2016.02.001
30
Пирсма, С.Р., Вармоэс, М.О., Де Вит, М., Де Реус, И., Нол, Дж.К., Хименес, CR. Процедура обработки всего геля для протеомики на основе GeLC-MS/MS. Протеом Наука. 11:17. 2013. https://doi.org/10.1186/1477-5956-11-17
31
Гарсия де Дуранго, К.Р., Монтейро, М.Н., Бейнсдорп, И.В., Фам, Т.В., Де Вит, М., Пирсма, С.Р., Нол, Дж.К., Перес-Гордо, М., Фейнман, Р.Дж.А., Видаль-Ванаклоча, Ф., Хименес, CR Регулируемая липополисахаридами секреция растворимых белков и белков на основе везикул из панели клеточных линий колоректального рака. Клиническое применение протеомики. 15:1900119. 2021. https://doi.org/10.1002/prca.201900119
32
Liu, H., Sadygov, R.G., Yates, J.R. A model for random sampling and estimation of relative protein abundance in shotgun proteomics. Analytical Chemistry. 76:4193–4201. 2004. https://doi.org/10.1021/ac0498563
33
Kim, T.K., Eberwine, J.H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397:3173-3178. 2010. https://doi.org/10.1007/s00216-010-3821-6
34
Брюйнс, Б.Б., Тиггелаар, Р.М., Гарденьерс, Дж.Г.Е. Флуоресцентные цианиновые красители для количественного определения небольших количеств дцДНК. Аналитическая биохимия. 511:74-79. 2016. https://doi.org/10.1016/j.ab.2016.07.022
35
Отчет о заседании ВОЗ. Исследовательская группа по клеточным субстратам для производства биологических препаратов. 1–30. 2007. Доступно онлайн: https://cdn.who.int/media/docs/default-source/biologicals/cell-substrates/cells.final.mtgrep.ik.26_sep_07.pdf (по состоянию на 25.06.2024)
36
Рауль, Д. Подтверждение наличия ДНК вакцины в вакцине Pfizer против COVID-19. Препринт 2024. https://hal.science/hal-04778576v1
37
Джонс, Л.Дж., Юэ, С.Т., Чунг, К.Ю., Сингер, В.Л. Количественное определение РНК с помощью анализа раствора на основе флуоресценции: характеристика реагента RiboGreen. Аналитическая биохимия. 265:368-374. 1998 год. https://doi.org/10.1006/abio.1998.2914
38
Кайзер, С.М, Кайзер, С.Р, Рейс, Дж, Маршалек, Р. Количественная оценка объективных концентраций примесей ДНК в мРНК-вакцинах. Препринт 2024. https://ssrn.com/abstract=5009375 http://dx.doi.org/10.2139/ssrn.5009375
39
Ян, Х. Установление допустимых пределов остаточной ДНК. Журнал фармацевтической науки и технологий. 67:155-163. 2013. https://doi.org/10.5731/pdajpst.2013.00910
40
Грасманн, М., Менне, Дж., Либлер, М., Гребер, И., Грасманн, А. Помощник по экспрессии генов - новая функция энхансера SV40. Исследования нуклеиновых кислот. 17:6603-6612. 1989 год. https://doi.org/10.1093/nar/17.16.6603
41
Янг, Дж.Л., Бенуа, Дж.Н., Дин, Д.А. Влияние последовательности ядерного нацеливания ДНК на перенос генов и экспрессию плазмид в интактной сосудистой сети. Генная терапия 10:1465-1470. 2003. https://doi.org/10.1038/sj.gt.3302021
42
Докладчик Переходящий обзор. 2020. Доступно онлайн: https://factreview.gr/wp-content/uploads/2023/07/Rolling-Review-Report-Quality-COVID-19-mRNA-Vaccine-BioNTech.pdf (по состоянию на 24.06.2024)
43
Монгколсук, С. Новые эукариотические векторы экспрессии, которые обеспечивают одноцепочечную репликацию в Escherichia coli и трансляционный анализ клонированных генов in vitro. Джин. 70:313-319. 1988 год. https://doi.org/10.1016/0378-1119(88)90203-x
44
Юрковецкий, Л., Ван, Х., Паскаль, К.Е., Томкинс-Тинч, К., Ньялиле, Т.П., Ван, Ю., Баум, А., Диль, В.Е., Дофин, А., Карбоне, К., Вейнотт, К., Эгри, С.Б., Шаффнер, С.Ф., Лемье, Ж.Е., Манро, Дж.Б., Рафик, А., Барве, А., Сабети, П.К., Кирацоус, К.А., Дудкина, Н.В., Шен, К., Лубан, Дж. Структурно-функциональный анализ варианта шипового белка D614G SARS-CoV-2. Клетка. 183:739-751.Е8. 2020. https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.09.032
45
Вачик, Дж., Дин, Б.С., Циммер, У.Е., Дин, Д.А. Клеточно-специфический ядерный импорт плазмидной ДНК. Генная терапия. 6:1006-1014. 1999. https://doi.org/10.1038/sj.gt.3300924
46
\Ndeupen, S., Qin, Z., Jacobsen, S., Bouteau, A., Estanbouli, H., Igyártó, BZ. Липидный компонент наночастиц платформы мРНК-LNP, используемый в доклинических исследованиях вакцин, обладает высокой воспалительностью. iНаука. 24:103479. 2021. https://doi.org/10.1016/j.isci.2021.103479
47
Джадли, А.С, Балласи, Н, Эдалат, П, Патель, В.Б. Внутри (вид) крошечного коммуникатора: биогенез экзосом, секреция и поглощение. Молекулярная и клеточная биохимия. 467:77-94. 2020. https://doi.org/10.1007/s11010-020-03703-z
48
МакКернан, К. Репликация плазмидной ДНК в клеточных линиях, вакцинированных BNT162b2. 2024. https://anandamide.substack.com/p/plasmid-dna-replication-in-bnt162b2
49
МХРА. Отчет об общественной оценке, Разрешение на временную поставку, вакцина против мРНК COVID-19 BNT162b2 (РНК BNT162b2), концентрат для приготовления раствора для инъекций. 2021. Доступно онлайн:https://assets.publishing.service.gov.uk/media/63529601e90e07768265c115/COVID-19_mRNA_Vaccine_BNT162b2__UKPAR___PFIZER_BIONTECH_ext_of_indication_11.6.2021.pdf)
50
Институт Пауля-Эрлиха. https://www.pei.de/EN/newsroom/hp-news/2021/211004-comirnaty-vaccine-shelf-life-extended.html
51
Институт Пауля-Эрлиха. https://www.pei.de/EN/newsroom/hp-news/2022/220421-comirnaty-shelf-life-extended-to-12-months.html
52
Институт Пауля-Эрлиха. https://www.pei.de/EN/newsroom/hp-news/2022/221230-comirnaty-shelf-life-extended.html
53
Parry, P.I., Lefringhausen, A., Turni, C., Neil, C.J., Cosford, R., Hudson, N.J., Gillespie, J. ‘Spikeopathy’: COVID-19 Spike Protein Is Pathogenic, from Both Virus and Vaccine mRNA. Biomedicines. 11:2287. 2023. https://doi.org/10.3390/biomedicines11082287
54
Поликретис, П., Донзелли, А., Линдсей, Дж.К., Уайзман, Д., Кириакопулос, А.М., Мёрц, М., Беллавите, П., Фукусима, М., Сенефф, С., Маккалоу, П.А. Аутоиммунные воспалительные реакции, вызванные генетическими вакцинами против COVID-19, в терминально дифференцированных тканях. Аутоиммунитет. 56:1. 2023. https://doi.org/10.1080/08916934.2023.2259123
55
Сегалла, Г. Химико-физическая критичность и токсикологический потенциал липидных наноматериалов, содержащихся в мРНК-вакцине от COVID-19. Международный журнал практики и исследований теории вакцин. 3:787-817. 2023. https://doi.org/10.56098/ijvtpr.v3i1.68
56
Малруни, Т.Е, Пёйри, Т, Ям-Пук, Дж.К, Раст, М, Харви, Р.Ф, Калмар, Л, Хорнер, Э, Бут, Л, Феррейра, А.П, Стоунли, М, Саваркар, Р, Ментцер, А.Дж, Лилли, К.С, Смейлс, К.М, фон дер Хаар, Т, Тертл, Л, Дуначи, С, Кленерман, П, Тавентиран, Дж.Э.Д, Уиллис, А.Е. N1-метилпсевдоуридилирование мРНК вызывает +1 сдвиг рамки рибосом. Природа. 625:189–194. 2024 https://doi.org/10.1038/s41586-023-06800-3
Поделитесь этим контентом
Подпишитесь на SciPublHealth
Научные знания, а не знания, продиктованные повествованием, являются целью WSES, и мы будем работать над тем, чтобы при формировании медицинских стандартов медицинской помощи и политики общественного здравоохранения использовались только объективные знания.
Об этой бумаге
Цитируйте эту статью
Кеммерер У, Шульц В, Штегер К. Инъекции COVID-19 на основе РНК BioNTech содержат большие количества остаточной ДНК, включая последовательность промотора/усилителя SV40. Наука, политика общественного здравоохранения и закон. 2024 г., 3 декабря; v5.2019-2024
Дата отправки:
02.07.2024
Комментариев нет:
Отправить комментарий